研究課題
細菌は、真核生物のようなタイプのN結合型糖鎖を、通常タンパク質に付加しない。しかしながら、近年、真核生物のN結合型糖鎖に作用するグリコシダーゼと相同性が認められるタンパク質の遺伝子が、細菌に存在することが明らかになっている。本研究は、このような細菌由来の機能未知グリコシダーゼを構造生物学の手法を用いて、その基質を明らかにし、応用につなげることを目的としている。本年度は、以下のとおりの成果を得た。（１）プロセシングα-グルコシダーゼIと相同性を有する機能未知酵素：機能未知酵素である大腸菌YgjKの立体構造については、これまでの研究ですでに決定済みである。本年度は、変異酵素を用い、β-グルコシルフルオリドとガラクトースの混合物を基質とし糖の酵素合成を行った。生成物は薄層クロマトグラフィーで分取し、得られた糖と酵素の複合体のX線結晶構造解析を行った。その結果、分解能2.0Åでの立体構造決定に成功し、生成物はGal-α-1,2-Glcであると同定された。（２）プロセシングα-グルコシダーゼIIと相同性を有する機能未知酵素：細菌の一菌株より遺伝子を取得し、pETベクターを用いて大腸菌での発現系を構築した。酵素はNi-NTAカラムによるアフィニティークロマトグラフィーで精製し、電気泳動的に単一バンドになるまで精製することができた。（３）エンドマンノシダーゼと相同性を有する機能未知酵素：Shewanella amazonensis 由来酵素の詳細な酵素化学的性質の解析を行い、Glc3Man3 およびGlc1Man3を蛍光物質で修飾した糖を、加水分解することを明らかにした。
2: おおむね順調に進展している
平成23年度は、プロセシングα-グルコシダーゼIと相同性を有する機能未知酵素である大腸菌YgjKについては、Ｘ線結晶構造解析を行い、生成した糖を同定することに成功した。これは糖加水分解酵素ファミリー63を用いたグリコシンターゼ化としては初めての例である。プロセシングα-グルコシダーゼIIと相同性を有する機能未知酵素については、大腸菌による生産および酵素の精製法を確立した。エンドマンノシダーゼと相同性を有する機能未知酵素については、酵素化学的性質を解析することができた。これらの成果は、論文や学会で発表を行っており、現在までの達成度は概ね順調であると考えている。
プロセシングα-グルコシダーゼIと相同性を有する機能未知酵素については、生成物の収率を高めることが課題である。反応条件の検討を行うとともに、糖加水分解酵素ファミリー63に属する他の酵素を用いることを検討する。プロセシングα-グルコシダーゼIIおよびエンドマンノシダーゼと相同性を有する機能未知酵素については、酵素を用いた糖の生成および酵素の結晶化の検討を行う。糖の生成については、野生型および改変酵素を各種糖に作用させ、どのような糖転移産物が生成するかクロマトグラフィーで確認する。結晶化の検討は、各種スクリーニングキットを用い、得られた結晶についてＸ線の回折が得られるかどうか調べる。
平成23年度では、申請書に記載した計画どおり、本研究の全体を通じて用いる立体構造解析に用いるサーバーの整備を行うことができた。平成24年度では、消耗品の使用が中心となる。酵素の改変等に用いる制限酵素やポリメラーゼなど各種遺伝子工学用試薬、酵素の生産のための各種培地、酵素の精製・結晶化のための各種試薬、研究全般に用いるプラスチック器具などの購入を予定している。また、糖の解析を行う研究補助者への謝金、成果発表のための旅費への使用を予定している。
すべて 2012 2011
すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件) 学会発表 (4件)
Glycoconj. J.
巻: 28 ページ: 563-571
10.1007/s10719-011-9356-z
