• 研究課題をさがす
  • 研究者をさがす
  • KAKENの使い方
  1. 課題ページに戻る

2012 年度 実施状況報告書

TAM受容体チロシンキナーゼのリガンド認識機構の解明と創薬に向けた分子基盤

研究課題

研究課題/領域番号 23570146
研究機関京都大学

研究代表者

永田 崇  京都大学, エネルギー理工学研究所, 助教 (10415250)

研究分担者 高橋 栄夫  横浜市立大学, その他の研究科, 教授 (60265717)
キーワードTAM受容体 / NMR / 糖鎖修飾
研究概要

これまでに、糖鎖修飾のない2つの複合体、Axl:Gas6複合体及びTyro3ホモダイマーの立体構造を鋳型としてTyro3及びMerの立体構造モデルを構築し、各々に関してGas6との推定結合界面を同定した。そして、Tyro3については、糖鎖修飾可能なAsnがGas6との結合界面及びホモダイマーの界面に位置することを見出した。この知見に基づき2つの変異体、Asn→Arg(NR)及びAsn→Cys(NC)を作製した。ゲルろ過により、NRとNCはそれぞれモノマーとダイマーであり、野生型(WT)はモノマー/ダイマーの平衡にあること、また、NRとWTは各々Gas6と結合するが、NCは結合しないことを見出した。今年度はまず、表面プラズモン共鳴法(SPR)を用いてNR、NC、WTについてGas6との結合能を解析した。その結果、NRとWTはGas6と同程度の強さで結合するとともに、いずれも一対一の複合体を形成することが示された。さらに、NRとWTについて15N標識体を調製し、NMR滴定実験によりGas6との結合界面を同定した。その結果、WTはモノマーとしてGas6と結合し、その結合界面はホモダイマー界面と重なることが示された。さらに、酵母を用いて糖鎖修飾されたTyro3(glycoTyro3)を調製し、解析を行った。まずゲルろ過によりglycoTyro3がモノマーであることを明らかにした。次に15N標識体を調製し、NMR測定を行い、糖鎖修飾部位を確定した。SPRによりglycoTyro3とGas6との結合を調べた結果、糖鎖修飾の有無は解離定数に大きな影響を及ぼさないことが示唆された。現在、glycoTyro3とGas6の結合様式を明らかにするため、NMR測定を行なっている。他方、Merについては各種大量調製方法を確立し、物性、構造及び機能解析に適した条件検討を進めているところである。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

これまでに、TAM受容体チロシンキナーゼの糖鎖修飾による物性、構造及び機能への影響を明らかにするために、主にTyro3に関する解析を進めてきた。その過程で、まず試料の調製について、大腸菌とK.lactisを用いてそれぞれ糖鎖修飾が無いTyro3と糖鎖修飾が有るglycoTyro3を調製する方法を確立した。一方、結合相手であるGas6は調製が困難であり、大腸菌及びK.lactisでは得られなかったため、ヒト細胞から調製する方法を確立した。次に物性については、ゲルろ過及びNMRにより解析する方法を確立し、結合については、表面プラズモン共鳴法及びNMRにより解析する方法を確立した。現在、glycoTyro3とGas6の結合様式を明らかにするため、NMRの方法のうちTransferred Cross Saturation法により測定を行なっているところである。その解析に必要なglycoTyro3の主鎖の帰属もほぼ完了している。以上、Tyro3について用いてきた方法は、全てそのままMerにも適用することが可能であり、目下、研究を進行させているところである。さらにMerについては、重水素標識及びアミノ酸選択的標識を施すための条件検討を進めており、ほぼ条件が収束したため大量調製をはじめたところである。以上のように、研究は概ね順調に進んでいる。

今後の研究の推進方策

TAM受容体チロシンキナーゼとGas6の認識機構を明らかにするため、引き続き解析を進める。Tyro3:Gas6複合体については、Transferred Cross Saturation法を用いて結合様式を明らかにする。Mer:Gas6複合体については、まず糖鎖修飾されたMerをK.lactisから、Gas6をヒト細胞から調製する。Merについては、さらに重水素化及びアミノ酸選択的標識を施し、結合部位についてNMRによる詳細な解析を行う。また、ゲルろ過、表面プラズモン共鳴法により物性及び機能に関する解析も行う。

次年度の研究費の使用計画

タンパク質の大量調製及び結合、物性の解析に必要な各種試薬、培地(安定同位体標識用の培地を含む)、消耗品等に当てる。また、打ち合わせ、情報交換などに必要な学会参加費及び旅費も必要となる

  • 研究成果

    (25件)

すべて 2013 2012

すべて 雑誌論文 (4件) (うち査読あり 4件) 学会発表 (20件) (うち招待講演 2件) 図書 (1件)

  • [雑誌論文] Anti-prion ctivity of an RNA aptamer and its structural basis2013

    • 著者名/発表者名
      Mashima, T., Nishikawa, F., Kamatari, Y., Fujiwara, H., Saimura, M., Nagata, T., Kodaki, T., Nishikawa, S., Kuwata, K. and Katahira, M.
    • 雑誌名

      Nucleic Acids Res

      巻: 41 ページ: 1355-1362

    • DOI

      10.1093/nar/gks1132.

    • 査読あり
  • [雑誌論文] NMR study of xenotropic murine leukemia virus-related virus protease in a complex with amprenavir2012

    • 著者名/発表者名
      Furukawa, A., Okamura, H., Morishita, R., Matsunaga, S., Kobayashi, N., Kodaki, T., Takaori, A., Ryo, A., Nagata, T. and Katahira, M.
    • 雑誌名

      Biochem. Biophys. Res. Commun.

      巻: 425 ページ: 284-289

    • DOI

      10.1016/j.bbrc.2012.07.083.

    • 査読あり
  • [雑誌論文] NMR study of ligand release from asialoglycoprotein receptor under solution conditions in early endosomes2012

    • 著者名/発表者名
      T. Onizuka, H. Shimizu, Y. Moriwaki, T. Nakano, S. Kanai, I. Shimada, and H. Takahashi
    • 雑誌名

      FEBS J.

      巻: 279 ページ: 2645-2656

    • DOI

      10.1111/j.1742-4658.2012.08643.x.

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Structural Basis for the Golgi Association by the Pleckstrin Homology Domain of the Ceramide Trafficking Protein (CERT)2012

    • 著者名/発表者名
      T. Sugiki, K. Takeuchi, T. Yamaji, T. Takano, Y. Tokunaga, K. Kumagai, K. Hanada, H. Takahashi, and I. Shimada
    • 雑誌名

      J. Biol. Chem.

      巻: 287 ページ: 33706-33718

    • 査読あり
  • [学会発表] NMR Real-time Monitoring of the Deamination Reaction of Human Antiviral Factor APOBEC3G2012

    • 著者名/発表者名
      K.Kamba, A.Furukawa, T.Kodaki, T.Nagata, M.Katahira
    • 学会等名
      第35回日本分子生物学会年会
    • 発表場所
      福岡国際会議場・マリンメッセ福岡(福岡市)
    • 年月日
      20121211-20121214
  • [学会発表] Creation of Novl Ribozyme whose Activity Switches on in Response to K+ via Quadruples Formation2012

    • 著者名/発表者名
      Y.Yamaoki, T.Mashima, Y.Sakurai, Y.Hara, T.Kodaki, T.Nagata, M.Katahira
    • 学会等名
      第35回日本分子生物学会年会
    • 発表場所
      福岡国際会議場・マリンメッセ福岡(福岡市)
    • 年月日
      20121211-20121214
  • [学会発表] NMRによるタンパク質相互作用とそのアロステリック阻害機構の解明2012

    • 著者名/発表者名
      高橋栄夫
    • 学会等名
      第35回日本分子生物学会年会・ワークショップ「NMRで見る タンパク質の機能発現」
    • 発表場所
      福岡国際会議場・マリンメッセ福岡(福岡市)
    • 年月日
      20121211-20121214
  • [学会発表] Strctural analysisi of RNA aptamer in complex with prion protein, and its anti-prion activity2012

    • 著者名/発表者名
      T.Mashima, F,Nishikawa, Y.Kamatari, H.Fujiwara, T.Nagata, T.Kodaki, S.Nishikawa, K.Kuwata. M.Katahira
    • 学会等名
      The 39th Internaional Symposium on Nucleic Acids Chemistry
    • 発表場所
      名古屋大学(名古屋市)
    • 年月日
      20121115-20121117
  • [学会発表] Development of intelligent ribozyme whose activity switches on in response to K+via quadruplex formation2012

    • 著者名/発表者名
      Y.Yamaoki, T.Mashima, Y.sakurai, Y.hara, T.Nagata, M.katahira
    • 学会等名
      The 39th Internaional Symposium on Nucleic Acids Chemistry
    • 発表場所
      名古屋大学(名古屋市)
    • 年月日
      20121115-20121117
  • [学会発表] プリオンタンパク質とRNAアプタマーの相互作用及び木質バイオマスの生分解のモニタリング2012

    • 著者名/発表者名
      真嶋司、西村裕志、岡村英保、西川富美子、鎌足雄司、永田崇、西村諭、桑田一夫、渡辺隆司、片平正人
    • 学会等名
      第51回NMR討論会
    • 発表場所
      ウインクあいち(名古屋市)
    • 年月日
      20121108-20121110
  • [学会発表] Pharmaceutical NMR techniques: NMR approach for ligand-based drug discovery2012

    • 著者名/発表者名
      H. Takahashi
    • 学会等名
      Pharmaceutical NMR lecture series in Osaka
    • 発表場所
      大阪大学(吹田市)
    • 年月日
      20121025-20121025
    • 招待講演
  • [学会発表] NMR approach for ligand-based drug discovery: DIRECTION approach for the pharmacophore mapping of drug candidates2012

    • 著者名/発表者名
      H. Takahashi
    • 学会等名
      The 3rd International Symposium on Drug Discovery and Design by NMR
    • 発表場所
      理研横浜研究所(横浜市)
    • 年月日
      20121012-20121012
    • 招待講演
  • [学会発表] カリウムイオン依存的な四重鎖構造形成によって活性がオンになるインテリジェントリボザイムの創製2012

    • 著者名/発表者名
      Y.Yamaoki, T.Mashima, Y.sakurai, Y.hara, T.Nagata, M.katahira
    • 学会等名
      日本生物物理学会第50回年会
    • 発表場所
      名古屋大学(名古屋市)
    • 年月日
      20120922-20120924
  • [学会発表] 抗HIV宿主因子 APOBEC3Gの位置依存的デアミネーション反応機構の解明2012

    • 著者名/発表者名
      A.Furukawa, K.Sugase, R.Morishita, T.Nagata, A.Takaori, A.Ryo, M.Katahira
    • 学会等名
      日本生物物理学会第50回年会
    • 発表場所
      名古屋大学(名古屋市)
    • 年月日
      20120922-20120924
  • [学会発表] NMR法によるAPOBEC3Gデアミネース活性に関する研究2012

    • 著者名/発表者名
      R.Iwaoka, S.Kitamura, K.Kanba, A.Furukawa, H.Okamura, W.Sugiura, T.Nagata, Y.Iwatani, M.Katahira
    • 学会等名
      日本生物物理学会第50回年会
    • 発表場所
      名古屋大学(名古屋市)
    • 年月日
      20120922-20120924
  • [学会発表] Anti-prion activity and it strucural basis of RNAaptamer, and sliding-direction-dependent deaminase activity of anti-HIV enzyme2012

    • 著者名/発表者名
      Mashima.T,Furukawa.A,Sugase.K,Fujiwara.H,Nishikawa.F,Morishita.R,Ryo.A,Kamatari.Y.Nagata.T,Nishikawa.S,Kuwata.K,Katahira.M
    • 学会等名
      XXV international Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems
    • 発表場所
      Lyon Convention Centre (France)
    • 年月日
      20120819-20120824
  • [学会発表] Elucidation of the location-dependent deamination reaction mechanism of an anti-HIV factor,APOBEC3G2012

    • 著者名/発表者名
      Furukawa.A,Sugase.K.Morishita.R,Ryo.A,akaori.A,Nagata.T,Katahira.M
    • 学会等名
      XXV international Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems
    • 発表場所
      Lyon Convention Centre (France)
    • 年月日
      20120819-20120824
  • [学会発表] Sequence-specific RNA-recognition mechanism of Musashi1,neural and oncogenic RNA-binding protein2012

    • 著者名/発表者名
      Ohyama.t,Nagata.t,Tsuda.k,Kobayashi.N,Imai.T,Okano.H,Yamazaki.T,Katahira.M
    • 学会等名
      XXV international Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems
    • 発表場所
      Lyon Convention Centre (France)
    • 年月日
      20120819-20120824
  • [学会発表] NMR analysis of the interaction between AML1 Runt domain and RNA aptamer2012

    • 著者名/発表者名
      Amano.R,Nomura.Y,Nagata.T,Fukunaga.J.Tanaka.Y.Katahira.M,Nakamura.Y,Kozu.T.Sakamoto.T
    • 学会等名
      XXV international Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems
    • 発表場所
      Lyon Convention Centre (France)
    • 年月日
      20120819-20120824
  • [学会発表] Anti-prion activity of RNA aptamer and the structural basis of its high affinity to prion protein2012

    • 著者名/発表者名
      Mashima,T,Nishikawa.F,Kamatari.Y,Fugiwara.H,Nagata.T,Kodaki.T,Nishikawa.S,Kuwata.K.Katahira.M
    • 学会等名
      Asia Pacific Prion symposium
    • 発表場所
      パシフィコ横浜(横浜市)
    • 年月日
      20120729-20120730
  • [学会発表] RNAアプタマーの抗プリオン活性とその構造的基礎2012

    • 著者名/発表者名
      真嶋司,西川富美子,鎌足雄司,藤原弘道,永田崇,小瀧努,西川諭,桑田一夫,片平正人
    • 学会等名
      第14回日本RNA学会年会
    • 発表場所
      東北大学(仙台市)
    • 年月日
      20120718-20120720
  • [学会発表] カリウムイオン濃度を感知して活性がオンになるインテリジェントリボザイムの創製2012

    • 著者名/発表者名
      山置雄大,真嶋司,櫻井佑,原ゆかり,永田崇,片平正人
    • 学会等名
      第14回日本RNA学会年会
    • 発表場所
      東北大学(仙台市)
    • 年月日
      20120718-20120720
  • [学会発表] RNAアプタマーとAML1 Runt domainの相互作用解析2012

    • 著者名/発表者名
      天野亮,野村祐介,永田崇,福永淳一,田中陽一郎,片平正人,中村義一,神津知子,坂本泰一
    • 学会等名
      第14回日本RNA学会年会
    • 発表場所
      東北大学(仙台市)
    • 年月日
      20120718-20120720
  • [学会発表] 抗HIV宿主因子APOBE3Gの位置依存的デアミネーション反応機構の解明2012

    • 著者名/発表者名
      古川亜矢子,菅瀬謙治,森下了,粱明秀,高折晃史,永田崇,片平正人
    • 学会等名
      日本蛋白質科学会年会
    • 発表場所
      名古屋国際会議場(名古屋市)
    • 年月日
      20120620-20120622
  • [図書] 生体有機化学2012

    • 著者名/発表者名
      高橋栄夫
    • 総ページ数
      220
    • 出版者
      東京化学同人

URL: 

公開日: 2014-07-24  

サービス概要 検索マニュアル よくある質問 お知らせ 利用規程 科研費による研究の帰属

Powered by NII kakenhi