研究課題
今年度は、TAM受容体チロシンキナーゼMerについて研究を進めた。まず、NMR研究に適した試料の調製方法を確立した。K.lactisを用い、マルトース結合タンパク質との融合タンパク質としてMerを発現させた。表現形の異なる各種菌株を用い、また各種培地を検討することで、効率の良い安定同位体標識化方法を見出した。親和性カラム、タグの切除、ゲルろ過により単一標品を得た。得られたMerの15N-HSQCスペクトルを測定した結果、期待されるシグナル数の80%が観測された。マイナー成分が確認されたので、引き続き糖鎖修飾の分析を行った。メジャーとマイナー成分を分離し、各々エンドグリコシダーゼ処理後質量分析を行った結果、メジャーとマイナーは各々糖鎖が1つと2つ付加したMerであった。次に、Merの糖鎖修飾が標的分子Gas6との結合に及ぼす影響をSPRにより解析した。その結果、糖鎖付加がゼロ>1つ>2つの順番で、Gas6との結合が弱くなることが示された。Merのメジャー成分について、更に他核多次元NMR法を適用し、50%程度のシグナルについて主鎖帰属が完了した。最後に、糖鎖が付加されていないMerとGas6との結合について、これまで解析を進めてきたTyro3の場合と比較した。SPRによる結合実験を各温度で行った。その結果、Gas6との結合は概ねTyro3の方がMerよりも強いことがわかった。本研究では、がん等の疾患標的分子でもあるTAM受容体チロシンキナーゼTyro3及びMer、標的分子Gas6について、糖鎖修飾を含む試料調製法及びNMR法などの構造・機能解析方法を整備することに成功した。今後は、各TAM受容体チロシンキナーゼに対する阻害分子の取得、及び得られた分子の活性評価に我々の研究成果が適用されることが期待される。
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