炎症微小環境ニッチとしてのヒアルロン酸ーＳＨＡＰ複合体の形成機構の研究

2011 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 23570148
• 研究機関: 愛知医科大学
• 研究代表者: 木全 弘治 愛知医科大学, その他部局等, 名誉教授 (10022641)
• 研究分担者: 卓 麗聖 愛知医科大学, 医学部, 准教授 (00399031)
• 研究期間 (年度): 2011-04-28 – 2014-03-31
• キーワード: 炎症 / 酵素 / 細胞接着 / ヒアルロン酸 / 血清タンパク質

研究概要

（１）酵素因子の精製：TSG-６強制発現したHLF細胞の培養上清の精製区分から、質量分析法で得た８個の候補蛋白質分子を、そのcDNAを細胞発現ベクターp3xFLAG-CMV14に組込み、細胞導入したところ、そのうち１個の候補で、細胞培養上清中から酵素活性が確認された。この候補分子が酵素そのものである決定的証拠を得るため、組換蛋白質の精製と活性確認を計画した。２種類の細胞発現ベクター（p3xFLAG-CMV14とpBFX）と1種類の大腸菌発現ベクター（pCold-GST）を試みたが、融合タンパク質を得ることができなかった。constructを配列確認済みであることや、コントロール発現は問題なくできたことから、発現系自身にミスがある可能性は低い。候補分子の塩基配列又はペプチト配列の特徴によって、DNA又は蛋白質が不安定で、分解された可能性も考慮に入れて、原因を追究中である。（２）two-hybrid法による酵素因子の探索：酵素因子がIaIのカラムに結合し、高塩濃度で溶離されることから、IaIの重鎖（HC1、HC2、 HC3）と親和性を持つと考えられる。この結果から、Two-Hybrid法で酵素因子のクローニングを計画した。ヒトHC1とHC2をBaitとし、GAL4蛋白質の結合ドメインとの融合蛋白質として酵母細胞株AH109に発現させた。それに、HLF細胞由来のcDNAライブラリーとpreyベクター（GAL4 activating domainを含むベクター）とともに導入し、ヒスチジン欠失培地で陽性クローンをスクリーニングした。得られた陽性クローンからHLF細胞由来のcDNAを増幅し、塩基配列を決定した。３回の実験のうち、２回以上スクリーニングされたcDNA４個を得た。これらのcDNAを発現ベクターに組込み、蛋白質発現と酵素活性の確認を行っている。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

候補分子の組換蛋白質の調製がうまく行かず、分解系が作用してしまったことが原因であろう。

今後の研究の推進方策

発現ベクター及び発現システム(無細胞発現システムを含む)を変えて、再度蛋白質の発現を試みる。一方、two-hybrid法で得られた候補因子の解析を急ぐ。

次年度の研究費の使用計画

次年度では、候補分子の組換蛋白質の発現失敗の原因を追究しながら、発現システムを改善し、蛋白質レベルにおいて、酵素活性を確認する。確認されれば、この新規酵素蛋白質の抗体を作成し、組織分布、特に炎症組織における分布を調べ、炎症におけるSHAP-HA高次構造体の形成における役割を解析する。さらに、アミノ酸置換実験や構造解析法で、その酵素の活性機構を解析する。さらに、ノックアウト作製に向けて、遺伝子情報の解析とターゲティングベクターの設計を行う。

研究成果

• [雑誌論文] Heparan Sulfate Subdomains that are Degraded by Sulf Accumulate in Cerebral Amyloid ß Plaques of Alzheimer's Disease: Evidence from Mouse Models and Patients (2012)
  • 著者名/発表者名: Hosono-Fukao T, Ohtake-Niimi S, Hoshino H, Britschgi M, Akatsu H, Hossain MM, Nishitsuji K, van Kuppevelt TH, Kimata K, Michikawa M, Wyss-Coray T, Uchimura K
  • 雑誌名: Am J Pathol 巻: １８０ ページ: 2056-67
  • DOI: 10.1016/j.ajpath.2012.01.015
  • 査読あり
• [雑誌論文] Restriction of mast cell proliferation through hyaluronan synthesis by co-cultured fibroblasts. (2012)
  • 著者名/発表者名: Takano H, Furuta K, Yamashita K, Sakanaka M, Itano N, Gohda E, Nakayama K, Kimata K, Sugimoto Y, Ichikawa A, Tanaka S
  • 雑誌名: Biol Pharm Bull 巻: 35 ページ: 408-12
  • 査読あり
• [雑誌論文] Crystallization and X-ray diffraction analysis of chondroitin lyase from baculovirus: envelope protein ODV-E66. (2012)
  • 著者名/発表者名: Kawaguchi Y, Sugiura N, Onishi M, Kimata K, Kimura M, Kakuta Y
  • 雑誌名: Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun 巻: 68 ページ: 190-2
  • DOI: 10.1107/S1744309111053164
  • 査読あり
• [雑誌論文] Enhanced Inflammation and Accelerated Wound Closure Following Tetraphorbol Ester Application or Full-Thickness Wounding in Mice Lacking Hyaluronan Synthases Has1 and Has3. (2012)
  • 著者名/発表者名: Mack JA, Feldman RJ, Itano N, Kimata K, Lauer M, Hascall VC, Maytin EV
  • 雑誌名: J Invest Dermatol 巻: １３２ ページ: 198-207
  • DOI: 10.1038/jid.2011.248
  • 査読あり
• [雑誌論文] Inhibition of hyaluronan synthesis in breast cancer cells by 4-Methylumbelliferone suppresses tumorigenicity in vitro and metastatic lesions of bone in vivo (2012)
  • 著者名/発表者名: Urakawa H, Nishida Y, Wasa J, Arai E, Zhuo L, Kimata K, Kozawa E, Futamura N, Ishiguro N
  • 雑誌名: Int J Cancer 巻: 130 ページ: 454-66
  • DOI: 10.1002/ijc.26014
  • 査読あり
• [雑誌論文] Inhibition of hyaluronan retention by 4-methylumbelliferone suppresses osteosarcoma cells in vitro and lung metastasis in vivo (2011)
  • 著者名/発表者名: Arai E, Nishida Y, Wasa J, Urakawa H, Zhuo L, Kimata K, Kozawa E, Futamura N, Ishiguro N
  • 雑誌名: Br J Cancer 巻: 105 ページ: 1839-49
  • DOI: 10.1038/bjc.2011.459
  • 査読あり
• [雑誌論文] Clinicopathological Role of Serum-Derived Hyaluronan-Associated Protein (SHAP)-Hyaluronan Complex in Endometrial Cancer (2011)
  • 著者名/発表者名: Yabushita H, Iwasaki K, Kanyama K, Obayashi Y, Zhuo L, Itano N, Kimata K, Wakatsuki A
  • 雑誌名: Obstet Gynecol Int 巻: 2011 ページ: 739150
  • DOI: 10.1155/2011/739150
  • 査読あり
• [雑誌論文] Heparan sulfate 6-O-sulfotransferase 1, a gene involved in extracellular sugar modifications, is mutated in patients with idiopathic hypogonadotrophic hypogonadism (2011)
  • 著者名/発表者名: Tornberg J, Sykiotis GP, Keefe K, Plummer L, Hoang X, Hall JE, Quinton R, Seminara SB, Hughes V, Van Vliet G, Van Uum S, Crowley WF, Habuchi H, Kimata K, Pitteloud N, Bülow HE
  • 雑誌名: Proc Natl Acad Sci U S A 巻: 108 ページ: 11524-9
  • DOI: 10.1073/pnas.1102284108
  • 査読あり
• [雑誌論文] Baculovirus Envelope Protein ODV-E66 Is a Novel Chondroitinase with Distinct Substrate Specificity (2011)
  • 著者名/発表者名: Sugiura N, Setoyama Y, Chiba M, Kimata K, Watanabe H
  • 雑誌名: J Biol Chem 巻: 286 ページ: 29026-34
  • DOI: 10.1074/jbc.M111.251157
  • 査読あり
• [雑誌論文] Sulfated Glycosaminoglycans Are Required for Specific and Sensitive Fibroblast Growth Factor (FGF) 19 Signaling via FGF Receptor 4 and betaKlotho (2011)
  • 著者名/発表者名: Nakamura M, Uehara Y, Asada M, Honda E, Nagai N, Kimata K, Suzuki M, Imamura T
  • 雑誌名: J Biol Chem 巻: 286 ページ: 26418-23
  • DOI: 10.1074/jbc.M111.251140
  • 査読あり
• [雑誌論文] Chondroitin sulfate N-acetylgalactosaminyltransferase 1 is necessary for normal endochondral ossification and aggrecan metabolism (2011)
  • 著者名/発表者名: Sato T, Kudo T, Ikehara Y, Ogawa H, Hirano T, Kiyohara K, Hagiwara K, Togayachi A, Ema M, Takahashi S, Kimata K, Watanabe H, Narimatsu H.
  • 雑誌名: J Biol Chem 巻: 286 ページ: 5803-12
  • DOI: 10.1074/jbc.M110.159244
  • 査読あり