| 研究課題/領域番号 |
23570210
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
鍋谷 彰 京都大学, 生命科学研究科, 助教 (40334495)
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| 研究期間 (年度) |
2011-04-28 – 2013-03-31
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| キーワード | テロメア / 組換え / ALT / 癌 |
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| 研究概要 |
ALT機構は一部のがん細胞などで機能しているテロメア維持機構であり、相同組換えが関与していることが示唆されている。その分子機構は未解明であるが、ALT機構には環状テロメアDNAが関わるという仮説を得ている。本課題はこの仮説を実証すること、すなわち、環状テロメアDNAによる染色体末端テロメアの伸長を検出し、その実験系を用いてALT機構およびその制御に関与する分子機構を解明すること、を目的としている。 環状テロメアDNAと染色体末端のテロメアDNAが相同組換えをおこすと、両者のDNAが一本に繋がった構造が形成される。これを特異的に検出するために、特定の染色体末端テロメアにタグ配列をもつALT細胞を使用した。環状テロメアDNAのモデルとして、テロメア反復配列と薬剤耐性マーカー遺伝子などの外来配列からなるDNAを作成した。また環状テロメアDNAモデルが細胞内でエピソーム（染色体外DNA）として安定して保持されるように、EBVベクターも利用した。これらを細胞に導入し、薬剤に対して抵抗性をしめす細胞、またはそのクローンを選択により得ることができた。これらの細胞からDNAを調製し、その構造をサザンハイブリダイゼーション法により検出した。その結果、環状テロメアDNAモデルに由来する特異的な配列は、ほとんどが環状またはその多量体として存在することが示された。この結果は、得られた細胞クローンの中では、導入した環状DNAモデルが主にエピソームとして存在していることを示す。これまでタグ配列を用いて特定の染色体テロメア、環状テロメアの構造変化や安定性を特異的に検出することが可能であることが示された。これは両者DNA間の相同組換えを検出するための基盤として重要である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成２３年度は、まず環状テロメアDNAに依存するテロメア伸長を検出することを目指した。そのための特定のテロメアDNAについて解析できる実験系の確立が第一段階であり、それについてはタグ配列を利用して可能となった。特定の染色体テロメアにタグ配列を付けた細胞株を使用したこと、環状テロメアDNAモデルにおいてもタグ配列を用いたことが鍵となった。この点は重要な進展として評価をしている。しかし第二段階、すなわちこの実験系を利用し、実際の伸長反応の検出に関しては、現在のところ達成されていない。恐らく環状テロメアモデルDNAが、予想以上に細胞内で安定的であり、宿主との相同組換えなどを起こしにくいと考えている。今後はこれについての解決、すなわちより特異性が高く、かつ高感度の検出が可能な実験を行うことが必要と考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
細胞に導入した環状テロメアDNAモデルと染色体末端DNAが、一本に繋がったDNAとして形成されているかを検出する。これまでの結果から、このような構造が形成される頻度は、あまり高くないと考えられる。そこでタグ配列を活用したPCR法により、相同組換えの結果形成された産物を増幅して検出する方法を検討する。またこれまでに、環状テロメアDNAモデルが導入された細胞を得る時、多くのクローンが薬剤選択により増殖が抑制されることを見いだしている。この過程を最適化および効率化により、解析対象となる細胞クローンをより多く得る。このようにして得た多数のクローンの解析、特に長期の培養により世代を経た時、そのテロメア構造にどのような変化が起こるかを経時的に解析する。そのとき、染色体末端にあるモデルDNA断片が、他の染色体テロメアや環状テロメアと組換えを起こすか、それらの過程を通してテロメア伸長を起こすか、などのDNA再編成に注目して研究をすすめる。また、元の細胞から得たより長いテロメアDNAを持つサブクローンを準備する。それを宿主として使用すると、テロメアDNA部分の相同性が高くなることから、組換え頻度の上昇が期待できる。その時の伸長したテロメアと環状テロメアDNAモデルとの相同組換えが起こっているかを調べ、検出系が改善されているかを調べる。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
上記の通り、昨年度の研究で当初の目的通りに環状DNAが導入された細胞を得る事ができた。しかしその頻度が高くなく、解析対象の細胞が期待したほど多く得られなかった。そのために生じた次年度に使用予定の研究費は、上記の推進方策に述べたクローン取得の最適化に必要である。またPCR法による検出およびその定量化の実験では、物品に多くの割合で使用する予定である。
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