| 研究課題/領域番号 |
23570211
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
米崎 哲朗 大阪大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (90115965)
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| 研究分担者 |
大塚 裕一 大阪大学, 理学(系)研究科(研究院), 助教 (10548861)
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| キーワード | T4ファージ / 大腸菌 / 吸着 / LPS / OmpC |
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| 研究概要 |
＜T４ファージの吸着とLPS構造＞大腸菌K12株がもつLPSの構造とT４の吸着能の関係を明らかにするために、LPS合成に関わる遺伝子の各種変異体について、それぞれに対するT４の吸着能を調べたところ、全てに吸着可能であったもののouter coreが小さくなるほど吸着能の低下が認められた。 また、inner coreの半分までを失った変異体ではouter core変異体のいずれよりも吸着能の低下が認められた。これらのことから、LPSのlipidAとinner coreの膜側半分があればT４は吸着可能であること、inner coreが完全長になり、さらにouter coreの構造が野生型に近づくほどT４の吸着能が上昇することがわかった。
＜T４ファージの吸着とOmpC要求性＞k12株への吸着にはLPSとOmpCを要求することが知られている。上記の様々な構造的変化をもつK12株変異体に△ompC変異を導入したところ、野生型および殆どのLPS変異体に吸着できなかった。しかし、outer coreとしてGlu I のみをもつ場合は吸着可能であった。このことから、T4はOmpCに依存せずLPSのみに依存して吸着可能な仕組みをもつことがわかった。
＜T４ファージの吸着とOmpC構造＞O157株のompに対してT４は吸着できない。K12のOmpCとO157のOmpCは相同性が高いものの、12カ所のアミノ酸置換やそれぞれの株に特有な４アミノ酸の挿入がある点で異なっている。今回、K12株特有な４アミノ酸挿入（GFTS）を削除したOmpCを作成したところ吸着できなかった。また、GFTS挿入を含むN末側はK12由来のアミノ酸配列をもち、C末側をO157由来のアミノ酸配列に置き換えたOmpCを作成したところ、弱いながら吸着可能であった。このことから、GFTSの重要性が認識された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
大腸菌K12株keioコレクションの充実により、LPS合成に関わる遺伝子の変異体を利用できるようになったおかげで、T４の吸着とLPS構造に関する過去の断片的な知見を系統的な知見に置き換えることが可能になった。しかし、その結果、LPSとOmpCという全く異なる分子種をコレセプターとして用いる吸着機構が予想を超える複雑な様相を見せてきたことから、LPSとの複合体形成によりOmpCのコンフォメーションが吸着によりふさわしい構造となる場合とLPSが単独でリセプターとして機能する場合の独立した２機構の存在を仮定するにいたった。そのため、当初想定したアプローチを変更し、LPSに依存したOmpCへの吸着機構とLPS単独への吸着機構を独立して解析するような手間が求められるようになった。また、いずれの場合も最適構造を変化させることにより低下した吸着能を回復させるT４変異体の単離とその解析を組み合わせることにより、それぞれの機構に必要なT４側の認識部位を特定する計画を実施に移したが、T４ファージのストックに含まれる解析可能な変異体が殆ど生じないことが問題となっている。これまでに得られた変異体は吸着効率が低く、その結果増殖力が低いため解析に必要なレベルのファージ濃度を得ることが困難である。このことは同時に、アミノ酸置換変異のレベルでは目標とする変異体が生じない可能性も示唆する。過去の例を参考にすれば、アミノ酸置換変異に比してアミノ酸挿入あるいは欠失変異の発生頻度は100～1000分の１であることから、T４ファージストックの濃度を数桁上昇させたものを用いて再チャレンジする必要があると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
K12とO157のOmpC構造の違いとT４吸着能の違いに焦点をあてた解析をさらに進めて、T４吸着に必要な最小アミノ酸配列構造やその２次構造を同定する。また、吸着不能なOmpCに吸着可能なT４ファージ変異体の単離作業を継続し、ファージ変異体の尾部線維構造変化との対応付けを行う。LPSのみをリセプターとする場合についても、吸着能を示さないLPSに吸着可能なT４ファージ変異体を単離し、LPS構造とファージ変異体の尾部線維構造変化との対応付けを行う。また、精製したLPSとT４ファージの直接的な相互作用についての解析を行う。
昨年度新たに浮上した課題、O157株がT４ファージの増殖を阻止する仕組みについて解析を開始する。T４ファミリーに属する、O157株で増殖可能なファージPPO1とT４との遺伝的組換えによるハイブリッドファージを分離することにより、O157株での増殖に必要なPPO1ファージ遺伝子の同定を試みる。また、PPO1 DNA断片のライブラリーを作成し、T４がO157株で増殖するのを助ける遺伝子の同定も試みる。さらに、O157株ゲノムDNA断片ライブラリーを作成し、K12株に導入したときT４の増殖を阻止するような遺伝子の探索も行う。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
当初の予想を超える複雑さを確認したため予定より多くの時間をかけて解析する必要が生じたこと、および新規の現象を発見したことによる新しい計画を遂行するために、当初の３年計画を４年に延長することを決定して研究費を繰り越したため。
全てを消耗品と研究会での発表に必要な旅費にあてる予定である。
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