研究課題
真核生物に普遍的に存在するERK/MAPキナーゼは、細胞内で多彩かつ重要な役割を果たしており、これまでに転写因子などの多数の基質が報告されている。本研究では、研究代表者らが開発したリン酸化プロテオーム解析法によって新たに同定したERK基質群について、リン酸化による機能制御を包括的に解明することを目標としている。本年度はマウス腎髄質内層集合管細胞 mIMCD-3にHaloタグを付加したFam129bと細胞質ダイニンの中間鎖Dync1i2を発現させ、細胞運動・管腔形成・3Dスフェロイド形成における生細胞イメージングを行った。さらにこれらの発現細胞からHaloタグリガンド固定化レジンを用いてFam129bやDync1i2との結合タンパク質をプルダウンし、質量分析計によってタンパク質の同定を行った。Dync1i2との結合タンパク質として同定されたp150Gluedは、Dync1i2がERKによってリン酸化されると結合のカイネティクスが変化することをBLI（バイオレイヤー干渉法）を用いた定量解析によって明らかにした。本研究によって、研究代表者がERK基質として同定したEPLIN、Fam129bおよびDync1i2が細胞運動や細胞接着などに関与することが明らかになった。また、Phos-tagウェスタンブロット法、質量分析計を用いたリン酸化部位の同定と定量、Haloタグを用いたイメージングと相互作用解析など、タンパク質のリン酸化による制御機構の解明において重要な解析技術を確立した。
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