| 研究課題/領域番号 |
23570275
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| 研究機関 | 熊本大学 |
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研究代表者 |
野見山 尚之 熊本大学, 大学院生命科学研究部, 講師 (00156225)
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| 研究期間 (年度) |
2011-04-28 – 2014-03-31
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| キーワード | ケモカイン / 遺伝子進化 / アカゲザル / タンパク質発現 / 翻訳 / タンパク質発現抑制 |
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| 研究概要 |
カニクイザル特異的なケモカイン遺伝子CXCL1LはmRNAは存在してもタンパク質発現は抑制される．その機構を明らかにすることを目的に，23年度は以下の実験を行った． (A) siRNAを用いた小胞体ストレス応答の確認．小胞体ストレスに関与する転写因子XBP1に対するsiRNAを用いて解析した結果，XBP1 mRNAは分解されたが，細胞質中のCXCL1Lタンパク質は増加せず，また培養上清中にタンパク質はほとんど検出されなかった．したがって，CXCL1Lタンパク質発現抑制への小胞体ストレスの関与は否定された． (B) Ex4による他遺伝子の発現抑制の確認．CXCL1L遺伝子によく似たアカゲザルケモカイン遺伝子CXCL1にCXCL1L遺伝子の第4エクソン(Ex4)を結合させると，CXCL1のタンパク質発現が抑制されることを見出していたが，今回はケモカインとは関係のない遺伝子，即ちルシフェラーゼ遺伝子にEx4を結合し，その発現を調べた．その結果，ルシフェラーゼ・タンパク質発現の抑制をウエスタンを用いて確認した． (C) ポリソーム解析を用いた翻訳抑制の確認．CXCL1LとCXCL1を細胞にトランスフェクションし，細胞質抽出液を用いてしょ糖密度勾配遠心法により，ポリソーム解析を行った．その結果，mRNA一分子に結合するリボソーム数に顕著な変化は見られなかったが，翻訳領域が短かったためとも考えられるので，今後ルシフェラーゼ遺伝子を用いて再度解析する予定である． (D) 無細胞翻訳系を用いた解析．ウサギ網状赤血球ライセートを用いて，in vitroでタンパク合成を行い，ウエスタンで解析したが，Ex4配列が存在してもタンパク質発現に変化は認められなかった．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初計画では5つの点において解析する予定であり，そのうちの4点においては結果を得たが，「Ex4による翻訳停止の検証」については発現ベクター構築に蛍光遺伝子DsRedを用いていたために，発現されたタンパク質の一部が核に移行するという異常な結果となってしまった．今後ベクターのデザインを再考し，実験をやり直す予定である．
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| 今後の研究の推進方策 |
23年度予定で結果を出せなかった「Ex4による翻訳停止の検証」および「ポリソーム解析を用いた翻訳抑制の確認」で遺伝子をルシフェラーゼに置き換えた実験を再度行い，さらに，申請書に記載した「翻訳および転写抑制に関わるEx4配列中の領域の同定」や「アカゲザルのEx4との比較」，「C-端が伸長した重複遺伝子の探索」を予定通り実施し，CXCL1L遺伝子のEx4配列によるタンパク質発現抑制機構について，さらに解析を進める．
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| 次年度の研究費の使用計画 |
設備備品としてウエスタン用のトランスブロットTurboシステム（Bio-Rad社）を購入予定である．これにより，ウエスタン実験の迅速化が図れる．また分子生物学会（福岡）で成果を発表予定であり，そのために，旅費を使用する．
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