| 研究課題/領域番号 |
23580099
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
新谷 尚弘 東北大学, (連合)農学研究科(研究院), 准教授 (70374973)
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| 研究期間 (年度) |
2011-04-28 – 2014-03-31
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| キーワード | オートファジー / 出芽酵母 |
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| 研究概要 |
出芽酵母を用いて、オートファジーの過程で形成されるオートファゴソームの形成に、小胞輸送における膜融合装置であるSNAREが関与するか解析した。また、オートファゴソームの前駆膜構造体であるPASの単離を試みた。出芽酵母に存在する24のSNAREのうち、19のSNAREの機能不全変異株を入手し、オートファジー活性の低下が見られるか解析した。大部分の変異株において、オートファジー活性の低下が確認された。特定の輸送経路に関わるSNAREの変異株においてオートファジー欠損が見られた訳ではないことから、小胞輸送ネットワークの不全による脂質膜のPASへの供給の低下がオートファジー不全に繋がったと考えられた。次に、オートファゴソームの膜脂質の起源を解析するため、PASの単離を行い、同構造体に含まれるタンパク質の解析を行った。オートファジーに必須なAtgタンパク質群の大半はPASに局在する。その中から、膜貫通タンパク質であるAtg9を選び、エピトープタグを融合したHA-Atg9を発現させた。細胞抽出液から、抗HA抗体でコーティングした磁気ビーズを用いて、HA-Atg9を含む膜構造体を分離した。対照実験として、エピトープタグを融合していないAtg9を発現する細胞を用いて、同様の実験を行った。分離した膜構造体から、非イオン性界面活性剤（Triton X-100）、イオン性界面活性剤（SDS）順を用いて順次タンパク質を溶出した。この画分に対して、種々のオルガネラマーカータンパク質に対する抗体を用いて、ウェスタンブロット解析を行ったところ、主に、ゴルジ体やエンドソームのマーカータンパク質が存在することが明らかとなった。このことから、ゴルジ体やエンドソームが主要なオートファゴソームの膜起源であることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の予定通り研究は進んでいる。
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| 今後の研究の推進方策 |
膜構造体（PAS）の単離実験を繰り返して行い、再現性よくPASを分離できる方法、手技を確立する。PAS画分に含まれるタンパク質、リン脂質の網羅的解析を行う。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
主に、プロテオーム解析、リピドーム解析並びに電子顕微鏡観察（研究計画通り）に経費を使用する予定である。
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