酢酸菌が行う酢酸発酵における残された課題：アセトアルデヒド酸化に関する研究

2013 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 23580115
• 研究機関: 山口大学
• 研究代表者: 藥師 寿治 山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (30324388)
• 研究分担者: 松下 一信 山口大学, 農学部, 教授 (50107736)
• キーワード: 酢酸菌 / アセトアルデヒド / 酢酸発酵 / アルデヒド脱水素酵素 / ユビキノン / 膜タンパク質 / パラログ / 遺伝子破壊

研究概要

酢酸発酵は，酢酸菌の細胞質膜の外側に存在するアルコール脱水素酵素（ADH）とアルデヒド脱水素酵素（ALDH）によって進行するが，アセトアルデヒド酸化を担う酵素，ALDHは十分に解析されていない。
研究期間を通して，酢酸菌Acetobacter pasteurianusのカノニカルALDH（AldFGH）とパラログALDH（AldSLC）の発酵生理学的な役割と酵素としての性状解析を行った。
発酵生理学的役割の解明には，カノニカルALDHをコードする遺伝子の1つ（aldH）の破壊株を作製した。この菌株（aldH株）は酢酸発酵を行うことができず，著量のアセトアルデヒドを蓄積した。よって，カノニカルALDHが酢酸発酵に必須であることがわかった。このaldH株を，aldSLCを持つプラスミドで形質転換し，パラログALDHだけを過剰に発現する酢酸菌が酢酸発酵可能であるかどうかを検討した。しかし，野生株と比較すると酢酸発酵可能であるとは言い難い結果となった。よって，パラログALDHは酢酸発酵を保証できないと結論づけた。
酵素としての性状解析のために，それぞれの遺伝子破壊株（aldFGH株とaldSLC株）とそれぞれの過剰発現株を作製した。この菌株を解析したところ，カノニカルALDHの方がパラログALDHよりもアセトアルデヒドに対する親和性が高く，より低いpHで最大活性を示すことがわかった。以上の内容を，第65回日本生物工学会大会にて発表した。
生化学的解析としてパラログALDHの精製を試みた。精製標品をSDS-PAGEで解析したところ，AldS，AldL，AldCと考えられる3種のバンドを示した。最も小さい分子量のバンドはN末端アミノ酸配列を解析し，AldSであることを確認した。よって，十分に精製できたと考えられた。

研究成果

• [雑誌論文] Overexpression of a type II 3-dehydroquinate dehydratase enhances the biotransformation of quinate to 3-dehydroshikimate in Gluconobacter oxydans (2014)
  • 著者名/発表者名: Nishikura-Imamura S, Matsutani, M, Insomphun C, Vangnai A.S, Toyama H, Yakushi T, Abe T, Adachi O, Matsushita K.
  • 雑誌名: Appl Microbiol Biotechnol 巻: 98 ページ: 2955-2963
  • 査読あり
• [雑誌論文] The electron transfer pathway in direct electrochemical communication of fructose dehydrogenase with electrodes (2014)
  • 著者名/発表者名: Kawai S, Yakushi T, Matsushita K, Kitazumi Y, Shirai O, Kano K.
  • 雑誌名: Electrochemistry Communications 巻: 38 ページ: 28-31
  • 査読あり
• [雑誌論文] Draft Genome Sequence of Dihydroxyacetone-Producing Gluconobacter thailandicus Strain NBRC 3255 (2013)
  • 著者名/発表者名: Matsutani, M., Kawajiri, E., Yakushi, T., Adachi, O., and Matsushita, K.
  • 雑誌名: Genome Announc 巻: 1 ページ: e0011813
  • DOI: 1/2/e00118-13 [pii] 10.1128/genomeA.00118-13
• [雑誌論文] Cyanide-insensitive quinol oxidase (CIO) from Gluconobacter oxydans is a unique terminal oxidase subfamily of cytochrome bd. (2013)
  • 著者名/発表者名: Miura, H., Mogi, T., Ano, Y., Migita, C. T., Matsutani, M., Yakushi, T., Kita, K., and Matsushita, K.
  • 雑誌名: J Biochem 巻: 153 ページ: 535-545
  • DOI: mvt019 [pii] 10.1093/jb/mvt019
  • 査読あり
• [雑誌論文] Change in product selectivity during the production of glyceric acid from glycerol by Gluconobacter strains in the presence of methanol. (2013)
  • 著者名/発表者名: Sato, S., Morita, N., Kitamoto, D., Yakushi, T., Matsushita, K., and Habe, H.
  • 雑誌名: AMB Express 巻: 3 ページ: 20
  • DOI: 2191-0855-3-20 [pii] 10.1186/2191-0855-3-20
  • 査読あり
• [学会発表] Acetobacter pasteurianus SKU1108の2つの膜結合型アルデヒド脱水素酵素の精製および特徴付け (2014)
  • 著者名/発表者名: 新納俊，児玉知大，松谷峰之介，片岡尚也，藥師寿治，松下一信
  • 学会等名: 日本生化学会中国四国支部例会
  • 発表場所: 愛媛大学（松山市）
  • 年月日: 20140606-20140607
• [学会発表] Acetobacter pasteurianus SKU1108アルデヒド脱水素酵素のパラログセットaldSLCは酢酸発酵を保証できない (2013)
  • 著者名/発表者名: 新納俊，児玉知大，藥師寿治，Theeragool Gunjana，松下一信
  • 学会等名: 日本生物工学会大会
  • 発表場所: 広島国際会議場（広島市）
  • 年月日: 20130918-20130920
• [備考] 山口大学農学部生物機能科学科応用微生物学研究室
  • URL: http://web.cc.yamaguchi-u.ac.jp/~oubi/