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2011 年度 実施状況報告書

トラフグ口白症病原体の正体をつきとめる -ゲノムからのアプローチ-

研究課題

研究課題/領域番号 23580261
研究機関福井県立大学

研究代表者

宮台 俊明  福井県立大学, 海洋生物資源学部, 教授 (20157663)

研究分担者 末武 弘章  福井県立大学, 海洋生物資源学部, 准教授 (00334326)
研究期間 (年度) 2011-04-28 – 2014-03-31
キーワード口白症 / ウイルス / トラフグ / 魚病
研究概要

トラフグの劇症脳炎である口白症の病原体と考えられているウイルスのゲノムの塩基配列を特定し、本症の病原ウイルスの正体をつきとめるのが本研究の目的である。感染したトラフグの脳を磨砕し、そのろ液をトラフグに筋注すると発症し、10日以内に死亡することから、病原体は脳で増幅すると考えられている。この脳磨砕ろ液を脳、卵巣の初代培養細胞、およびトラフグ眼由来の細胞株に接種すると、ウイルスが増幅することから、これらの細胞が感受性を持っていることはこれまでの研究で明らかにした。感染した卵巣細胞培養を電子顕微鏡で観察したところ、ヒトのC型肝炎ウイルスに酷似するウイルス粒子を見ることができた。また、C型肝炎ウイルスに感染した細胞の内部構造変化に極めて類似した変化を認めた。この事実から、口白症ウイルスはC型肝炎ウイルスが属するフラビウイルス科であると仮定し、ゲノム解読実験を開始した。 フラビウイルスには3属あり、それぞれの属を特徴づける保存された塩基配列領域が存在する。そこで、その領域の塩基配列情報を元にしてプライマーを作製し、ウイルス感染培養細胞の培養上清を鋳型に用いて、RT-PCRを行った。しかし、ウイルスと見られるクローンは全く得ることができなかった。 そこで、RNAウイルスだけでなく、DNAウイルスも解析の対象に加え、網羅的にウイルスゲノムをクローニングするをRDV法(Rapid Determination System of Viral RNA Sequences)を用いてクローニングを開始した。現在、数10個のトラフグゲノム以外の塩基配列を得たものの、相同性解析によればPseudomonasをはじめとする細菌類だけがクローニングされている。今後はウイルス試料の調製法とRDV法を改善し、口白症ゲノムのクローンを得る努力を続ける。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

(1)当初予測していたフラビウイルス科のゲノム配列と一致する部分をクローニングできなかったことに、大きな躓きがあった。あらゆる可能性を調べつくしたと言っても過言ではないほどの努力を払ったにも関わらず、検出できなかったことから、口白症ウイルスには、既知のフラビウイルスが持っている保存配列は全くない、と言わざるを得ない。そこで、サブトラクション法を用いて、感染脳特異的なゲノム配列の探索を行ったものの、トラフグゲノム由来、特にリゾゾーマルRNA網羅的ウイルスゲノム配列が増幅されることが多く、現在のところ成功していない。(2)感染脳からウイルスを精製する方法は確立している。硫酸プロタミンによる宿主DNAの沈殿除去、ヨード系媒体(血管造影剤)を用いた密度勾配遠心、硫酸セルロファインを用いた吸着クロマトグラフィーである。これらの各ステップで得られた分画をトラフグに接種して発症するかどうかをチェックすることにより、ウイルス分画を得る。これらの方法は長時間を要するだけでなく、各ステップでウイルス活性のロスを招く。(3)本ウイルスは延髄から脊椎においてわずかに観察されるにも関わらず、劇症の急性感染症を引き起こす。予測されていた事実ではあるが、ウイルスの絶対量が少ないこともゲノム解析を困難にしている原因であると考えている。

今後の研究の推進方策

第1の問題点(既知のフラビウイルスに共通する配列はなかった)を解決するために、サブトラクション法に加えて、網羅的に未知ウイルスのゲノムを読み解くためのツールであるRDV法を導入する。現在、既に何回かのRDVの試みを行っているところであり、さらに継続することによって、口白症ウイルスゲノムクローンを得ることを目指す。 第2の問題点(精製過程でウイルス量が減少する)を解決する方法としては、ウイルス感受性培養細胞を使用する、という選択がある。現在広く使用されている細胞株では全く増殖が見られない。トラフグ脳細胞の初代培養、トラフグ卵巣の初代培養、およびトラフグ眼由来細胞株の3種類だけが口白症に感染する。この中で、最も感染感受性が高いのは、トラフグ脳初代培養細胞である。ところが、脳1個からは1mLの培養しか得ることができない。そのため、大量の口白症ウイルスを得ることはできない。しかし、複雑な精製操作を行わなくとも純度の高いウイルス粒子を得ることができる。少量ではあるものの、他の細胞に比べて多くのウイルスを得られる可能性は高い。ここで得られたウイルスを用いて、上記のサブトラクション、RDVを行えば、ウイルスゲノムをクローニングできるのではないか、と考えている。第3の問題点(ウイルスの絶対量が少ない)を解決する方策は今のところ考え付かない。そこで、視点を変えて、ウイルス量が少ないのに、なぜ急性で致死的な感染症を発症するのか、という課題に目を向けようと考えている。感染脳の病理組織像、および頭骸骨内へ浸出する液性成分量が増加することから、炎症性反応が起きている、と推測している。当研究室の分子免疫学のスキルを用いて、脳内炎症反応の実態を明らかにすることを目指す。

次年度の研究費の使用計画

上記の研究推進策から、ほとんどの研究費は分子生物学的手法を用いるための試薬と消耗品に費やす予定である。 一部はプロジェクト研究員の人件費に用いる。 なお、平成23年度において生じた残額、8696円は、平成24年度受け入れ分と合わせて、試薬類等に充てる予定である。

  • 研究成果

    (20件)

すべて 2012 2011

すべて 雑誌論文 (4件) (うち査読あり 4件) 学会発表 (16件)

  • [雑誌論文] Teleost IL-6 promotes antibody production through STAT3 signaling via IL-6R and gp1302012

    • 著者名/発表者名
      Kaneda M、Odaka T、Suetake H、Tahara D、Miyadai T.
    • 雑誌名

      Developmental and Comparative Immunology

      巻: 38 (2) ページ: 224-231

    • DOI

      10.1016/j.dci.2012.02.002

    • 査読あり
  • [雑誌論文] The plasmablast-like leukocyte in the kidney of fugu (Takifugu rubripes)2011

    • 著者名/発表者名
      Tomoyuki Odaka、Shigeyuki Tsutusi、Ryuichi Sugamata、Hiroaki Suetake、Toshiaki Miyadai、Yuzuru Suzuki、Tasuku Watanabe、Osamu Nakamura
    • 雑誌名

      Fish & Shellfish Immunology

      巻: 30(2) ページ: 682-690

    • DOI

      10.1016/j.fsi.2010.12.018

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Milky hemolymph syndrome associated with an intranuclear bacilliform virus in snow crabs Chionoecetes opilio from the Sea of Japan2011

    • 著者名/発表者名
      Toshi Kon、Tadashi Isshiki、Toshiaki Miyadai、Yoshiharu Honma
    • 雑誌名

      Fisheries Science

      巻: 77(6) ページ: 999-1007

    • DOI

      10.1007/s12562-011-0405-0

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Functional analysis of fish BCL-6 and Blimp-1 in vitro: Transcriptional repressors for B-cell terminal differentiation in fugu (Takifugu rubripes)2011

    • 著者名/発表者名
      Maki Ohtani, Toshiaki Miyadai
    • 雑誌名

      Molecular Immunology

      巻: 48 ページ: 818-825

    • DOI

      10.1016/j.molimm.2010.10.018

    • 査読あり
  • [学会発表] トラフグIL-6は分泌型抗体遺伝子の発現を誘導する2012

    • 著者名/発表者名
      金田充・小高智之・末武弘章・宮台俊明
    • 学会等名
      日本水産学会
    • 発表場所
      東京海洋大学
    • 年月日
      2012年3月29日
  • [学会発表] トラフグ抗体の親和性成熟の簡易測定2012

    • 著者名/発表者名
      前田知己・末武弘章・小高智之・宮台俊明
    • 学会等名
      日本水産学会
    • 発表場所
      東京海洋大学
    • 年月日
      2012年3月29日
  • [学会発表] ヒラメの腎臓および脾臓におけるウイルス感染に対する応答の比較2012

    • 著者名/発表者名
      藤井崇文・仲山 慶・北村真一・宮台俊明
    • 学会等名
      日本水産学会
    • 発表場所
      東京海洋大学
    • 年月日
      2012年3月29日
  • [学会発表] ウイルス性出血性敗血症に対するホルマリン不活化ワクチンを接種されたヒラメにおける免疫関連遺伝子の発現2012

    • 著者名/発表者名
      森本嵩也・一色 正・吉松隆夫・末武弘章・宮台俊明
    • 学会等名
      日本水産学会
    • 発表場所
      東京海洋大学
    • 年月日
      2012年3月29日
  • [学会発表] トラフグWT1AはAMHR2の転写因子である2012

    • 著者名/発表者名
      松浦健太・宮台俊明・末武弘章・菊池潔
    • 学会等名
      日本水産学会
    • 発表場所
      東京海洋大学
    • 年月日
      2012年3月27日
  • [学会発表] トラフグの性決定遺伝子1-トラフグの性はおそらく一塩基で決定されている2012

    • 著者名/発表者名
      菊池潔・神谷隆史・岡あゆみ・甲斐渉・田角聡志・細谷将・水野直樹・鈴木重則・末武弘章・宮台俊明・鈴木譲
    • 学会等名
      日本水産学会
    • 発表場所
      東京海洋大学
    • 年月日
      2012年3月27日
  • [学会発表] トラフグの性決定遺伝子2-組換え・ヘミ接合・重複・発現-2012

    • 著者名/発表者名
      菊池潔・岡あゆみ・田角聡志・細谷将・藤田真志・鈴木重則・末武弘章・宮台俊明・鈴木譲
    • 学会等名
      日本水産学会
    • 発表場所
      東京海洋大学
    • 年月日
      2012年3月27日
  • [学会発表] トラフグの性決定遺伝子3-性決定遺伝子の誕生と死、あるいは遺存-2012

    • 著者名/発表者名
      渥美九郁・神谷隆史・甲斐渉・山野上祐介・細谷将・城夕香・末武弘章・宮台俊明・高谷智裕・宮木廉夫・鈴木譲・菊池潔
    • 学会等名
      日本水産学会
    • 発表場所
      東京海洋大学
    • 年月日
      2012年3月27日
  • [学会発表] トラフグの性決定遺伝子4.HRM解析によるトラフグ性判別法の開発と性転換家系の解析2012

    • 著者名/発表者名
      家田梨櫻・松永貴芳・田角聡志・末武弘章・宮台俊明・鈴木重則・中村修・鈴木譲・菊池潔
    • 学会等名
      日本水産学会
    • 発表場所
      東京海洋大学
    • 年月日
      2012年3月27日
  • [学会発表] トラフグ生殖腺へのエストラジオール・フルタミドの影響2011

    • 著者名/発表者名
      松浦健太・宮台俊明・末武弘章・菊池潔
    • 学会等名
      日本水産学会
    • 発表場所
      長崎大学
    • 年月日
      2011年9月29日
  • [学会発表] トラフグのゲノム地図の作成とその応用:性決定遺伝子、性統御、比較ゲノム解析の話題を中心に2011

    • 著者名/発表者名
      菊池潔・甲斐渉・細谷将・田角聡志・末武弘章・宮台俊明・鈴木譲
    • 学会等名
      日本水産学会
    • 発表場所
      長崎大学
    • 年月日
      2011年9月29日
  • [学会発表] 墨汁投与時のトラフグ二次リンパ組織における免疫応答2011

    • 著者名/発表者名
      前田知己・末武弘章・田内博久・金田充・臼井陽子・菊池潔・鈴木譲・宮台俊明
    • 学会等名
      日本比較免疫学会
    • 発表場所
      海洋研究開発機構横浜研究所
    • 年月日
      2011年8月21日
  • [学会発表] トラフグ腎臓に存在する形質芽球様細胞2011

    • 著者名/発表者名
      小高智之・筒井繁行・宮台俊明・菅又龍一・末武弘章・鈴木譲・中村修
    • 学会等名
      日本比較免疫学会
    • 発表場所
      海洋研究開発機構横浜研究所
    • 年月日
      2011年8月21日
  • [学会発表] トラフグgp130はSTAT3をリン酸化する2011

    • 著者名/発表者名
      金田充・末武弘章・宮台俊明
    • 学会等名
      日本比較免疫学会
    • 発表場所
      海洋研究開発機構横浜研究所
    • 年月日
      2011年8月21日
  • [学会発表] トラフグケモカイン受容体、CCR7、CCR102011

    • 著者名/発表者名
      田内博久・菊池潔・鈴木譲・末武弘章・宮台俊明
    • 学会等名
      日本水産学会
    • 発表場所
      海洋研究開発機構横浜研究所
    • 年月日
      2011年8月21日
  • [学会発表] トラフグ体表粘液を利用したゲノムマーカーによる簡易雌雄判別2011

    • 著者名/発表者名
      松浦健太・宮台俊明・菊池潔・岩谷芳自・梅津寛之
    • 学会等名
      日本水産学会中部支部
    • 発表場所
      朱鷺メッセ(新潟市)
    • 年月日
      2011年11月12日

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公開日: 2013-07-10  

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