| 研究課題/領域番号 |
23580422
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
小林 剛 大阪大学, 微生物病研究所, 特任准教授 (90324847)
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| キーワード | ワクチン / デング熱 |
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| 研究概要 |
本研究はデングウイルス（DV）における新規DNAワクチンの開発を目的としている。平成24年度は、以下の研究成果が得られた。
1) DVにおけるDNA-basedリバースジェネティクス系を応用したレプリコンシステムの開発 新規DNAワクチン開発の基盤技術として、細胞内にウイルスcDNAを直接導入することにより、効率の高い組換えウイルスの作出が可能なDNA-basedリバースジェネティクス系を用いたSingle-round感染性ウイルス粒子産生系の開発は必須である。本年度は、構造蛋白質領域（C、prM、E）をレポーター遺伝子（ルシフェラーゼ）に置換したDNA-based DVレプリコンシステムの開発を行った。レプリコンを導入した培養細胞では安定したルシフェラーゼ発現が認められ、抗DV薬剤スクリーニングにおいても有用であることが確認された。
2) DVにおける宿主相同組換え機構を利用した新規リバースジェネティクス系の開発 先行研究で開発に成功したダニ媒介性脳炎ウイルスの宿主相同組換え機構を利用した新規リバースジェネティクス系をDVに応用した。DV DNA-based感染性cDNAクローンを鋳型に全長をカバーするように両末端に各々隣接する領域に対して重複領域を含む断片のフラグメントを増幅した。増幅したフラグメントを培養細胞にコトランスフェクションした結果、24時間後に感染性ウイルスが得られた。
本年度、開発に成功した基盤技術は本研究課題を遂行する上で非常に有用と考えられる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究目的は4価Single-round感染性DNAワクチンの開発を行うことである。DNAワクチン候補となるSingle-round感染性ウイルス粒子産生システムの開発のため、DNA-basedリバースジェネティクス系を応用したレプリコンシステムの確立を行うことは必須の研究項目である。
本年度は、DV1型におけるDNA-basedレプリコンの構築、宿主の相同組換え機構を利用したリバースジェネティクス系の開発に成功した。現在、DV1型レプリコン導入細胞に構造蛋白質をトランスに供給することでSingle-round感染性ウイルス粒子の産生を試みている。さらに、他の型におけるレプリコンシステムの構築ならびにSingle-round感染性ウイルス粒子産生システムの開発にも着手していることから、研究目的を達成する上で本年度の研究計画はおおむね順調に進展していると思われる。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後の研究の推進方策として以下の研究項目を推進する。
1) 4価Single-round感染性組換えウイルス粒子産生系の開発 構築に成功したDV1型レプリコンcDNAおよび1～4型の構造蛋白質発現プラスミドを標的細胞に導入することで4価Single-round感染性組換えウイルス粒子を作出する系の開発を行う。
2) DV カプシド（C）蛋白質欠損DNA-basedレプリコンの作製 既に開発に成功しているDNA-based DV1型感染性cDNAクローンを用いてCタンパク質領域を欠損させたDV1型レプリコンcDNAを構築する。さらに、Cタンパク質をトランスに供給するため、同一プラスミドに独立したCタンパク質発現カセットのクローニングを行う。
3) Single-round感染性ウイルス粒子の産生効率の評価 構築したレプリコンシステムを用いたSingle-round感染性ウイルス粒子の産生効率をin vitro（培養細胞）で解析・評価する。Single-round感染性ウイルス粒子の高効率産生系を確立後、実験動物を用いたin vivo免疫実験を行う。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
本年度は実験計画の都合上、研究費に繰越金が生じた。そのため、次年度は繰越金から本年度に購入できなかった消耗品、実験動物を購入する予定である。次年度請求金額については申請書に沿って、今後の推進方策を実施するため、実験に必要な分子生物学関連および細胞組織培養関連等の消耗品、実験動物の購入に使用する予定である。
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