| 研究課題/領域番号 |
23580454
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| 研究機関 | 北見工業大学 |
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研究代表者 |
佐藤 利次 北見工業大学, 工学部, 准教授 (00390881)
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| キーワード | ラッカーゼ / シイタケ / 遺伝子発現ベクター / ウルシ / 遺伝子発現系 |
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| 研究概要 |
本研究では、担子菌類の中でも安全性が高く有用性が高い食用担子菌類の効率的な遺伝子導入法を確立すること、及び、ラッカーゼなどの有用遺伝子発現ベクター系を確立することを目的とする。本年度は、シイタケに関する遺伝子導入法簡便化の検討、シイタケラッカーゼ遺伝子lcc1発現ベクター導入シイタケ株の解析、及び漆ラッカーゼ遺伝子の単離について検討した。
遺伝子導入法に関しては、エレクロトロポレーターによるシイタケ裁断菌糸への直接導入法によるシイタケの形質転換を試みたが、組換え体は得られなかった。そこで、プロトプラスト調製法の簡便化に関して検討を行った。その結果、本培養時に残存する菌糸を再利用することで、前々培養が省略可能となった。
シイタケ用ベクターとして構成的発現遺伝子（グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子：gpd）プロモータを利用したベクターに、シイタケlcc1遺伝子を挿入した pChG-lcc1をPEG-CaCl2 法によって得られた形質転換体に関して解析を行った。その結果、宿主株よりも2倍以上ラッカーゼ活性の高い組換え株が選抜され、gpd遺伝子プロモータからのlcc1遺伝子の発現が、RT-PCR法により確認できた。
次に、漆のラッカーゼ遺伝子をシイタケで発現させるために、漆の葉から漆ラッカーゼ遺伝子cDNAの単離を試みた。DDBJに登録されている漆ラッカーゼ遺伝子情報をもとに、RACE法により漆ラッカーゼ遺伝子cDNA全長の配列 Tvlcc を単離し、その配列を決定した。その結果、既知情報と、DNA配列で15塩基の違いがあることが明らかとなった。また、新規に、漆ラッカーゼ遺伝子cDNAの、5‘非翻訳領域、N末端のシグナルペプチド領域、及び3’非翻訳領域の配列を明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
遺伝子導入法の簡便化については、菌糸への直接遺伝子導入が難しいことが明らかになったが、プロトプラスト調製法に関する簡便化に関して進展が認められた。シイタケの発現ベクターに関しては、ラッカーゼ発現の高い組換え体が確認でき、ベクターからの特異的な遺伝子発現を確認できた。この結果から、pChGベクターのシイタケにおける異種発現ベクターとしての有用性が明らかとなった。また、漆ラッカーゼ遺伝子の単離に関しては、漆ラッカーゼ遺伝子Tvlccの全長cDNAを単離できたことから進展が認められた。総合して考えると、おおむね順調に進展していると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
遺伝子導入条件に関しては、細胞壁溶解酵素処理によるプロトプラスト調製条件に関する検討を行い、最終的にプロトプラストへのエレクトポレーションによる遺伝子導入の検討を行う。また、新規に構築したシイタケlcc1遺伝子発現抑制RNAiベクターのシイタケへの遺伝子導入について検討し、新規RNAiベクターの有効性について検討する。また、漆ラッカーゼ遺伝子発現ベクターpChG’-Tvlccを構築後は、このベクターのシイタケへの導入に関しても検討し、得られた組換え体に関して解析を行う。
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