| 研究課題/領域番号 |
23590120
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| 研究機関 | 帝京平成大学 |
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研究代表者 |
枝川 義邦 帝京平成大学, 薬学部, 教授 (50303607)
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| キーワード | 細胞死 / 薬理学 / アポトーシス / マイクロ流体デバイス / ミクロ薬理学 |
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| 研究概要 |
本研究は細胞死の詳細なメカニズムについて、単一細胞レベルでの検討を行うものである。そのために本年度は開発したマイクロデバイスの最適化とライブイメージング等による細胞内イベントの可視化を行うために、まず細胞体や突起部のパターニングを実現すべく、デバイス底面形状の改善を行った。培養皿底面にpolydimethylsiloxane (PDMS)を200 umの細胞体部と5 um幅の突起部が並んだ形状を施したシートをマウントさせることで培養デバイスを作製した。この培養皿上にPC12細胞を播種・培養し、NGFを含んだ培養液により分化させることで突起伸長を誘発させたところ、突起伸長を狙ったマイクログルーブに沿った突起伸長が認められたことにより、今年度に新規開発した培養皿は、神経様細胞のパターニングを実現するものであり、本研究における細胞体部と突起部のパターニングを施した微小培養に資するものであると考えられた。
また本年度は、単一細胞における細胞内イベントの可視化を目的としたライブイメージングの検討も行った。本研究における検討対象はストレス誘発性の細胞死であることから、その経過にCaspaseの活性化を含むことが予想される。そこで昨年度の検討結果を踏まえて、本年度はCaspaseの活性化に伴い色彩変化を生じる蛍光プローブを用いることで、活性化Caspaseの細胞内での位置情報獲得の実現性を検討した。蛍光タンパク質のGFPとAlexaを擁した蛍光プローブにおいてCaspase-3の活性化誘発性に部位離脱的にFRET関連様で蛍光色を変化させる細胞内蛍光プローブを用いたところ、Sturosporine (2uM) 暴露によるストレス誘発性の細胞内変化をモニタリング可能であることが確認された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究における当該年度の計画では、微小培養した単一細胞のパターニングによる細胞体部と突起部の分離制御とライブイメージングによる細胞内イベントの可視化を予定していたことから、本年度の研究ではこれらがおおむね順調に行われており、次年度の研究計画に速やかに移行可能であると評価するものである。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度には、マイクロデバイス内で微小培養した単一細胞について、パターン化させた細胞体部および突起部のポジショニングを実現すべく、本年度に検討したパターニング法をマイクロ流体デバイス内へ導入することを検討する。また、本年度に導入した蛍光プローブを用いたライブイメージングとマイクロデバイス内でのミクロ薬理学的検討との融合により、細胞死誘発刺激により活性化される細胞内イベントに纏わる位置情報を獲得することを計画している。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
本研究の推進に必要な細胞生物学・薬理学研究関連の試薬を含む消耗品は必須ものである。また、マイクロデバイス作製に必要な消耗品等、申請時の計画書に記載しているものは計画通りに使用する予定である。さらに学会参加や投稿論文による成果報告に纏わる費用やそのための解析に必要な計算機等を用意することも計画している。
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