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本研究では、単一培養細胞における細胞死の位置特異的情報の獲得に向けたマイクロシステムの構築とその応用を目的とするものである。本年度は、得られた情報の整理とそれに基づいたシステムの最適化を行った。本研究で使用しているマイクロデバイスは、生体適合性の高い高分子化合物polydimethylsiloxaneを固化・成形することで、デバイス内に細胞培養関連の微小環境を形成したものである。これは、複数個の単一細胞を空間的に孤立させた状態で非侵襲的な捕獲とその場所での微小培養を実現するものであり、デバイス内のデザインはこれまでにも検討を重ねたものである。初年度より継続的に細胞生物学関連領域のデザインの最適化を試みたところ、10の5乗個レベルの孤立化細胞を培養液の微小流とともにデバイス内に注入することで、孤立化した単一細胞の捕獲がほぼ確実に行えることが再現でき、また、捕獲細胞が神経成長因子により形態変化を生じ突起を伸長する過程が再現可能であった。さらに、デバイス内の微小環境において充分な突起長に伸長させた後に層流による位置特異的な薬液曝露を行うとともに培養細胞の細胞死に至る細胞内シグナルの可視化も行えることを確認した。蛍光プローブを用いたライブイメージングによりStaurosporine曝露が及ぼす影響の検討では、活性型Caspase-3に対してFRET関連様に蛍光色を変化させるGFP・Alexaの蛍光プローブを用いることで薬液曝露のストレス誘発性に蛍光色を変化させることを確認した。また、細胞死に至るストレスが細胞内の位置特異的に生じせしめられているかの検討では、ストレス負荷が細胞核付近での活性型Caspase-3発現を誘発するためには突起部のマイクロドメインに限局した薬液刺激で充分であること、および、刺激領域から細胞体への細胞死情報の伝達が必要であることが明らかになった。
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