| 研究課題/領域番号 |
23590413
|
|---|
| 研究機関 | 埼玉医科大学 |
|---|
研究代表者 |
東 守洋 埼玉医科大学, 医学部, 講師 (00323395)
|
|---|
| 研究分担者 |
田丸 淳一 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (30188429)
|
|---|
| キーワード | 悪性リンパ腫 / Mastermind / Notchシグナル / 免疫組織化学 |
|---|
| 研究概要 |
Mastermind はNotchシグナルを正に制御し芽中心B細胞からmarginal zone B-cellへの分化に重要な役割をはたす。Notch についてはその遺伝子変異により恒常的に活性化されたNotchがT細胞性急性白血病発生に関与することが知られている。しかしながらB細胞リンパ腫での意義は不明である。本研究では芽中心由来のB細胞性リンパ腫、特にホジキンリンパ腫におけるMastermin の発現と役割について解析することを目的とした。これまでにMastermindを検出するための免疫組織化学の方法の確定、検討する症例データベースの作製、実際の染色を主に行った。まずMastermind蛋白同定のための免疫組織化学法の検討を各種細胞株における蛋白発現についてWestern blot法および免疫組織化学により検討した。抗体の選定、染色条件の決定を行った。リンパ腫症例においてはB細胞リンパ腫症例(ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、辺縁帯B細胞リンパ腫)の症例データベースを構築し現在これらの症例について発現検討を遂行中でる。リンパ腫症例の検討と併せて正常リンパ節におけるB細胞分化とMastermind発現の検討を行なっている。正常リンパ節においてはGC内B細胞のうちどの細胞に発現しているか各種分化マーカーとの共発現を免疫組織化学により検討している。Mastermindと分化マーカーとの二重染色の条件を検討、決定した。Mastermind発現の有無による細胞分離をフローサイトメトリーで行う予定であったが、Matermindの陽性細胞からのタンパク回収について各種ウエスタンブロットに必要な量行えていない。組織化学的な検索を詳しく行うことでこの問題点を解消しようと考えている。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
1. Mastermind蛋白同定のための免疫組織化学法の検討：各種細胞株における蛋白発現をWestern blot法および免疫組織化学により検討した。抗体の選定、染色条件も決定し得た。
2. リンパ腫症例におけるMastermind発現の検討：一部症例で臨床情報が不足しているが、その数は全体症例の数％であり、研究遂行に問題はない。
3. Mastermindの発現と臨床病理学的特徴の検討: 症例の基本情報の解析は終了した。
4. Mastermind発現の有無による細胞分離をフローサイトメトリーで行う予定であったが、Mastermindの陽性細胞からのタンパク回収が各種ウエスタンブロットに必要な量行えていない。組織化学的な検索を詳しく行うことでこの問題点を解消しようと考えている。
|
| 今後の研究の推進方策 |
今後は悪性リンパ腫におけるMastermindの役割について検討する。正常リンパ節におけるB細胞分化段階におけるMastermind発現の有無を、各種分化マーカーとの共発現の有無で検討する。次に悪性リンパ腫におけるMastermindの機能解析を目的とし、芽中心由来のものを含む各種B細胞株にMastermind分子を遺伝子導入もしくはRNAiによるノックダウンを行い1) Notchシグナルへの影響2)細胞増殖およびアポトーシスへの影響3)マーカー分子発現の変化について検討する。1）NotchシグナルについてはNotchシグナルの標的であるHes-1 promoterを用いたルシフェラーゼアッセイまたはNotch遺伝子の標的probeを用いたゲルシフトアッセイで行う。各種培養細胞株間でNotchシグナルの反応に違いがあるか検討する。2）Mastermindによる細胞増殖およびアポトーシスに影響については、増殖能はMTTアッセイを用いて、アポトーシスについてはTunnel法を用いて検討する。3）分化マーカーの変化については免疫組織化学で行う。免疫組織化学的には蛍光顕微鏡を用いて蛋白局在についても検討する。
|
| 次年度の研究費の使用計画 |
各種マーカーについて免疫組織化学的に検討するため、抗体、染色試薬等の消耗品を購入する。免疫組織化学的な検討のため、蛍光顕微鏡を用いるが、適切な顕微鏡用フィルターも必要である。またin vitroでの検討のため細胞培養に必要な血清、培地、プラスチックウェアを購入する。in vitroの検討には遺伝子組換を行うが、組換えに必要なred組み込みcompetent cellを購入する。
|
