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トキソプラズマ(Toxoplasma gondii)のミトコンドリアとアピコプラストに特異的に見いだされたピルビン酸キナーゼII (PKII)がどのように基質を得ているのかをホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(PEPCK)の解析で行った。ピルビン酸キナーゼは通常は解糖系の酵素でミトコンドリアには存在しない。アピコプラストはトキソプラズマなどの胞子虫に特異な細胞内小器官で、ピルビン酸キナーゼの基質であるホスホエノールピルビン酸(PEP)のトランスポーターの存在が明らかである事から申請の課題では解析を行わない。
トキソプラズマの遺伝子上には２種類のPEPCKが存在すると考えられている。I型の酵素はトキソプラズマのmRNAから簡単にPCRで存在が確認されるが、II型の酵素は確認されなかった。取りあえずI型の酵素の遺伝子組み換え体の作製を幾つかの発現ベクター系を用いて行った。しかし通常行われるpET系やpGEX系の発現ベクター系では成功しなかった。そこで低温でタンパク質を発現させるpCold-TF系での発現を行ったところ低濃度であるが発現に成功した。しかし複合タンパク質である発現物より単一な酵素を得ることは非常に難しく、PEPCKの酵素活性の測定は可能であったが，その他の実験は申請の実験課題条件下では不可能であった。そこで今年度は特にII型の酵素の検出を再度条件の検討により行った。DNAポリメラーゼの種類を幾つか替えた事とアニーリングの温度設定により目的とされる大きさの遺伝子を得ることがようやくできた。現在遺伝子の塩基配列を確認中である。
研究の年度内課題達成にはたどり着かなかったが、各種の実験条件の課題はようやくクリアーでき、最終的な課題の最終目標まで今一歩の状態である。
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