| 研究課題/領域番号 |
23590522
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| 研究機関 | 東京女子医科大学 |
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研究代表者 |
春田 郁子 東京女子医科大学, 医学部, 講師 (80221513)
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| 研究分担者 |
八木 淳二 東京女子医科大学, 医学部, 教授 (70182300)
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| 研究期間 (年度) |
2011-04-28 – 2016-03-31
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| キーワード | 自己免疫性膵炎 / 細菌 / 自然免疫 / 慢性炎症 / 自己抗原 / 分子相同性 / 自己抗体 |
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| 研究概要 |
C57BL/6マウスにE. coli を長期投与したマウスで、ヒト自己免疫性膵炎（AIP）に類似した、膵臓の膵管周囲に著明な細胞浸潤と線維化を認めた。また、これらのマウスの唾液腺でも導管周囲に著明な細胞浸潤を認めた。膵臓の浸潤細胞は病態が完成した時期ではＣＤ３+細胞が優位であった。また、膵臓の炎症はE. coli 投与終了後も持続し、E. coli の追加投与なく10ヶ月以上経過したマウスでも膵臓に炎症が見られることが明らかとなった。これらのマウス血清中では、抗lactoferrin(LF)抗体、抗carbonic anhydrase(CA)II抗体の値が高値で、ヒトAIPと同様の傾向がみられ、抗LF、抗CAII 抗体価は経時的に上昇した。更に、E. coli を投与したマウスの脾細胞をRAG2-/-マウスに移入した結果、ドナーマウスのAIP様の膵炎が、レシピエントマウスに生じることが確認でき、自己反応性細胞の移入でAIP様の膵炎が再現できることが証明された。 E. coli 長期投与マウスにおける炎症の機序を明らかにするため、１）病原因子の特定を目標に、E. coli 蛋白の2次元電気泳動を行いメンブレンにトランスファーしてE. coli を長期投与しAIP様の膵炎を生じたマウス血清と反応させ、血清との反応性を検討した。次いで、E. coli 長期投与マウス血清の反応したスポットを切り出してMALDI-TOF/MSにて解析を行い、病原因子となり得る可能性のある物質を検出した。現在2個以上の候補が得られ、その物質の特定を行い、それらの物質の反復投与でE. coli長期投与と同様に、膵臓の炎症が生じるかの検討を行っている。２）並行して候補病原物質のモノクローナルを作製している。また、３）脾細胞を中心に、リンパ球などの細胞表面マーカーの解析を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成23年度の研究計画に挙げた項目に関して、下記のごとく研究を進めている。１．細菌による自然免疫賦活が自己免疫を誘導することの検証；normal C57BL/6あるいはBALB/cマウスにE. coli を長期間投与したAIPのモデルマウスを用いて、 (1)膵臓・唾液腺の組織変化を調べ、膵の著明な細胞浸潤と膵管周囲の線維化・唾液腺導管周囲の細胞浸潤を認めることを明らかとし、(2)血中抗ラクトフェリン抗体、抗carbonic anhydrase抗体を測定し、これらの抗体価がE. coli長期投与マウスで経時的に上昇することを明らかとし、(3)E. coli を投与したマウスの脾細胞をRAG2-/-マウスに移入してAIP様の膵炎が、レシピエントマウスに生じるこをを証明し、(4)C57BL/6と異なるstrain のBALB/cマウスに同様にE. coli を長期間投与し、膵臓・唾液腺の炎症が生じることを観察した。２．病原因子（動物モデルにおける細菌免疫原性蛋白）の同定；E. coli の蛋白分画に対して2次元電気泳動を行い、AIPモデルマウスの血清と反応する蛋白を検出し２個以上の候補となるスポットを検出し、MALDI-TOF/MSにて病原因子の可能性のある物質の候補を検討した。３．免疫担当細胞の応答性の検討；AIPモデルマウスを用いて、E. coli長期刺激後の脾細胞の表面マーカーの解析を行い、更に、サイトカインのレギュレーションを検討した。
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| 今後の研究の推進方策 |
１．病原因子に関して、E. coli の免疫原性蛋白をベクターから発現させ分離精製し、次いで、特定された病原因子の抗原提示細胞上に表出されるぺプチドを同定する。更に、同定された病原因子のノックアウト株を作製しwild typeとの比較を行う。２．免疫担当細胞の応答性の検討；AIPモデルマウスを用いて、特定された病原因子の認識機構、サイトカインの関与の検討、自己反応性Ｔ細胞の相互作用の検討を行う。３．molecular mimic な自己抗原の病態に関与の可能性などを検討し、また、特定された病原因子/ペプチドに対する抗体を作成し、病態との関連を検討する。４．マウスモデル実験で得られた知見と、ヒト臨床で見られる現象を対比検討し、マウスモデルで得られた結果を臨床にフィードバックしていく。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
研究費の使用予定は、疾患モデルマウスの作製のためのマウスの購入、病理組織学的解析における免疫染色などに用いる各種抗体、電子顕微鏡観察に関連する物品の購入、各種合成ペプチド、細胞培養のための器具や培養液などの消耗品購入費用、また、結果を国際学会雑誌に報告するための経費などである。以下積算根拠を記す。 AIPモデルの作製に際して、各種 strain のマウスを購入する。また、細菌/菌体成分の作製に培養液・試薬、フラスコ、プラスチック製品等を使用する。AIPモデルの免疫組織検討に各種抗体、試薬、ガラス製品を用い、血清サイトカインなどの測定にキットを購入する。また、イムノグロブリンのアイソタイプを調べ反応がTh2誘導性に生じているかなどを調べる目的でＩｇアイソタイプ測定キットなどを使用する予定である。病原因子の解析、候補ペプチドなどを用いてin vitroでの反応も合わせて検討していくため細胞培養に培養液、牛胎児血清を使用する。更に、TLR4, MyDD88などの免疫応答への関与を調べる予定であり、各々のノックアウトマウス等も購入予定である。血清中の自己抗体ELISA、ウエスタンブロットなどで行い、免疫原性蛋白の解析をTOF/MSなどで行うため、抗体、プラスチック製品、メンブレン、試薬などを使用する。また、病原因子のpathogenicなepitopeの同定のため、deletion mutantなども適宜作製していく予定であり、このmolecularな解析のために各種酵素の購入なども予算に計上した。また候補因子のペプチドの合成やプライマーの合成も含めて使用する予定である。 研究成果は国内・国際学会で発表し、英文で論文発表していく。英文論文投稿に際してプロフェッショナルな英文校正を発注する予定でありこの経費の予算を計上した。また、論文掲載のための印刷代を予算に計上した。
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