研究課題
Th17細胞は、最近新しく発見されたヘルパーT細胞の亜集団であるが、このTh17細胞の過剰な活性化が自己免疫疾患の発症および増悪化に関与することが示唆されている。よって、Th17の活性化は厳密に制御される必要がある。しかしながら、Th17の活性化を負に調節する分子機構はこれまでのところほとんど解明されていない。申請者は、これまでの研究により、LIM蛋白ファミリーに属する核内ユビキチンリガーゼPDLIM2 (PDZ and LIM domain protein-2)が、LIMドメインを介してSTAT3分子のユビキチン化・分解を誘導することにより、STAT3によるTh17分化を負に調節することを明らかにした。また、昨年度までの研究で、同じくLIM蛋白ファミリーに属するPDLIM4が、脱リン酸化酵素であるPTP-BLをリクルートして、STATの活性化に必須のチロシン残基を脱リン酸化することによりSTAT3を介するシグナル伝達を負に制御することを見出した。さらに、PDLIM4遺伝子のLIMドメイン内の一塩基多型が、ヒトの関節リウマチの疾患感受性に関係することも明らかにした。本年度は、同じくLIM蛋白に属するPDLIM1とPDLIM7がSTAT3の活性を負に制御することを明らかにした。PDLIM7はPDLIM2と同じく核に局在しており、ユビキチンリガーゼ活性を有していた。またPDLIM7はPDLIM2と結合したことから、PDLIM7がPDLIM2とヘテロダイマーを形成して相乗的にユビキチンリガーゼとして働くことが示唆された。一方、PDLIM1は細胞質内に存在し、ユビキチンリガーゼ活性を有しておらず、PDZドメインを介してアクチン結合蛋白であるα-actininと結合して、転写因子を細胞質内に留めて核への移行を阻害することによりシグナル伝達を負に制御することが明らかになった。
3: やや遅れている
本申請研究の研究計画の３番目に、「PDLIM2およびPDLIM4以外のLIM蛋白ファミリー因子がSTAT3の活性化およびTh17細胞分化を負に制御するかどうかを、培養細胞レベルおよびノックアウトマウスを用いた個体レベルの実験手法を用いて解明する」という計画を申請した。この研究計画に関して、本年度は、上記のように培養細胞レベルの実験において、PDLIM1およびPDLIM7がSTAT3のシグナルを負に制御すること、および、その分子メカニズムを明らかにした。しかしながら、ノックアウトマウスの作成に手間取ったため、現時点ではノックアウトマウスは得られてたものの、計画していた解析を始めたところであり、まだ全くデータは得られていない。この研究計画の項目に関して、「研究目的」の達成がやや遅れていると考えている。
PDLIM1およびPDLIM7のノックアウトマウスを用いて、これらのLIM蛋白が個体レベルでのTh17細胞分化を負に制御するかどうかの解析を行う。具体的には、まず、野生型およびPDLIM1およびPDLIM7欠損マウスの脾臓またはリンパ節よりCD62L陽性CD4陽性のナイーブT細胞を採取し、抗CD3抗体およびIL-6+TGFβ存在下で４日間培養することによりTh17細胞分化を誘導する。この細胞におけるIL-17, IL-21, IL-22などのサイトカインの発現をreal time PCR法で調べることにより、これらのノックアウトマウスにおいてTh17細胞分化が亢進しているかどうかを解析する。生体においては、細菌・真菌感染の際にTh17細胞の分化が強力に誘導され、これらの病原微生物の排除にTh17細胞が重要な役割を果たしていることが明らかになっている。また、細胞内寄生細菌感染の際の肉芽腫の形成にTh17細胞が必須であることも報告されている。そこで、細胞内寄生細菌であるPropionibacterium acnes (P.acnes)の加熱死菌を野生型およびPDLIM1およびPDLIM7欠損マウスに投与して、個体レベルでTh17細胞分化を誘導する。そして、７日後の脾臓CD4陽性T細胞からのIL-17などのサイトカインの産生、および、肝臓における肉芽腫の形成がこれらのノックアウトマウスにおいて亢進しているかどうかを調べることにより、これらのLIM蛋白が個体レベルにおいてもTh17分化を負に制御するかどうかを解析する。
本申請研究の研究計画の３番目に、「PDLIM2およびPDLIM4以外のLIM蛋白ファミリー因子がSTAT3の活性化およびTh17細胞分化を負に制御するかどうかを、培養細胞レベルおよびノックアウトマウスを用いた個体レベルの実験手法を用いて解明する」という計画を申請した。この研究計画に関して、本年度は、培養細胞レベルの実験において、PDLIM1およびPDLIM7がSTAT3のシグナルを負に制御すること、および、その分子メカニズムを明らかにした。しかしながら、ノックアウトマウスの作成に手間取ったため、現時点ではノックアウトマウスは得られてたものの、計画していた解析を始めたところであり、まだ全くデータは得られていない。このために未使用額が生じた。PDLIM1およびPDLIM7のノックアウトマウスを用いて、これらのLIM蛋白が個体レベルでのTh17細胞分化を負に制御するかどうかの解析を行う。具体的には、まず、野生型およびPDLIM1およびPDLIM7欠損マウスの脾臓由来CD4陽性T細胞を用いて、これらのノックアウトマウスにおいてTh17細胞分化が亢進しているかどうかを解析する。さらに、細胞内寄生細菌であるPropionibacterium acnes (P.acnes)の加熱死菌を野生型およびPDLIM1およびPDLIM7欠損マウスに投与して個体レベルでのTh17細胞分化を誘導することにより、これらのLIM蛋白が個体レベルにおいてもTh17分化を負に制御するかどうかを解析する。以上の実験のための、リアルタイムPCR、ELISA、ウェスタンブロッティング、FACSなどの解析に未使用額を使用する。
すべて 2013 その他
すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件) 学会発表 (3件) (うち招待講演 2件)
J. Immunol.
巻: 190 ページ: 6071-6082
10.4049/jimmunol.1202798
