Ａｐｏｐ遺伝子を標的とした抗加齢療法の創出

2011 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 23590886
• 研究機関: 熊本大学
• 研究代表者: 安田 修 熊本大学, 医学部附属病院, 特任准教授 (00372615)
• 研究分担者: 樂木 宏実 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (20252679) ; 福尾 惠介 武庫川女子大学, 生活環境学部, 教授 (40156758)
• 研究期間 (年度): 2011-04-28 – 2014-03-31
• キーワード: 老化

研究概要

Apoptogenic Protein (Apop)はミトコンドリアに存在するタンパク質であり、筆者らによって動脈硬化プラークで発見された。Apopを発現した細胞はアポトーシスを起こし、逆にApop遺伝子の発現を抑制した細胞では生存率が上昇する。本研究の目的はApopが細胞および個体の老化に関与していることを明確にすることである。　心筋特異的にApopを欠損したコンディショナルKOマウスを得るためApop遺伝子がLoxP配列にはさまれたマウスと心筋特異的Cre発現マウスの交配を行い、心筋特異的なApop欠損マウスを得た。このマウスの心臓に虚血再還流を施して有用な知見を得た。この結果はApop遺伝子発現が心筋梗塞治療後に発症する心不全に関わる可能性を示している。　Apop遺伝子の発現をノックダウンした培養血管内皮細胞においては活性酸素種（ROS）産生の増加が見られた。高血糖条件下で培養した正常細胞においてもROS産生増加が見られたが、Apopノックダウン細胞を高血糖条件下で培養してもROS産生増加は見られなかった。この結果はApop遺伝子の抑制が高血糖条件下と同様な機構でROS産生を誘導していることを示しており、糖尿病による血管障害がApop遺伝子制御によって軽減できることを示唆している。またApopノックダウン細胞ではbeta-galactosidase発現が認められ、細胞老化が進行していることが明らかになった。以上より、Apop遺伝子が個体老化の原因ともなる血管老化に関係していることが明らかとなり、老化抑制のための標的遺伝子として有用であることが示された。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

Apoptogenic Protein (Apop)遺伝子の発現はアポトーシスを誘導するが、これはApopが有している機能の一部であると考えられている。本年度の研究においてApop遺伝子の発現を抑制した細胞では老化関連beta-galactosidase活性が亢進することから、Apopは細胞老化にも関わっていることを明らかにできた。本研究の目的であるApop遺伝子発現と老化の関連を細胞レベルで明らかにできたことによって本研究は大きく前進したと思われる。老化した血管内皮細胞では機能が低下しているものと予想される。Apop遺伝子抑制した内皮細胞では内皮機能の一つであるeNOS（内皮型NO合成酵素）発現も低下しており、老化とともに機能も低下していることを明らかにできた。老化を促進する因子として知られている活性酸素種（ROS）が知られているが、ROS産生をFACS解析によって定量的に解析し、Apop遺伝子抑制がROS産生を増加させていることも明らかに出来た。Apop欠損（KO）マウスにおいては寿命が変化していることが予想される。寿命測定に必要な多数のマウスを同時に得るためKOマウスから採取した精子ならびに卵子による体外受精を行い、必要数のKOマウス産仔を得ることに成功した。また本年度の研究の目標のひとつであるApop遺伝子を心筋細胞でで特異的に欠損したコンディショナルノックアウトマウスの作製に成功した。

今後の研究の推進方策

Apoptogenic Protein (Apop)遺伝子発現が細胞ならびに個体の老化に関与していることを明らかにするための研究を継続して遂行する。細胞およびマウス個体を用いた解析を行う。本年度はsiRNAによってApop遺伝子発現を抑制した細胞を用いた研究で多くの有用な知見を得たが、来年度はApop遺伝子欠損（KO）マウスの表現型解析に特に重点を置いた研究を行う。高齢者の代表的な疾患である心筋梗塞や脳梗塞の原因となる動脈硬化発症とApop遺伝子発現の関連を解析し、発症予防の可能性を追求する予定である。また国内あるいは海外の学会で研究成果の発表を行う予定である。　次年度に使用する予定の研究費があるが、これは本年度実施予定の血管内皮機能の解析が研究結果を踏まえて解析手法の見直しが必要となったため、本年度は手法の再考期間とし、詳細な解析は来年度に実施することになったためである。次年度においては血管内皮機能解析とともに血圧解析も合わせて行う予定である。

次年度の研究費の使用計画

次年度の研究を推進させるために必要な設備として、熊本大学総合研究棟の蛍光顕微鏡、遠心機および超遠心機、活性酸素種の定量的測定のためのFACSが使用可能な状況にある。また遺伝子発現解析のための電気泳動関連機器、培養細胞観察のための位相差顕微鏡、ならびに染色組織観察のための蛍光顕微鏡が利用可能である。また培養細胞におけるApopならびに代謝関連遺伝子等の発現解析のためにはReal Time PCRを用いて定量的な解析を行うが、そのためにBioRad CFX384 Real-Time Systemが使用可能であり、必要な施設・設備はすべて使用可能な環境にある。したがって新たな機械、設備をそろえる必要性はなく、研究経費は消耗品費を中心に利用される。必要な消耗品として各種の試薬類のほか、免疫組織科学のための抗体、遺伝子多型解析のためのプライマー、血管平滑筋細胞を培養するための細胞培養用品があげられる。消耗品のなかには組織解析のための染色キット、遺伝子発現解析、転写制御因子の解析等のための各種の実験キットも含まれる。

研究成果

• [雑誌論文] CVD-associated non-coding RNA, ANRIL, modulates expression of atherogenic pathways in VSMC (2012)
  • 著者名/発表者名: Congrains A, Kamide K, Katsuya T, Yasuda O, Oguro R, Yamamoto K, Ohishi M, Rakugi H
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun 巻: 419 ページ: 612-616
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2012.02.050
  • 査読あり
• [雑誌論文] Case report of a long-surviving Werner syndrome patient with severe aortic valve stenosis (2012)
  • 著者名/発表者名: Kawai T, Nozato Y, Kamide K, Onishi M, Yamamoto-Hanasaki H, Tatara Y, Takemura Y, Yamamoto K, Takeya Y, Sugimoto K, Kusakabe N, Yasuda O, Ohishi M, Rakugi H
  • 雑誌名: Geriatr Gerontol Int 巻: 12 ページ: 174-175
  • DOI: 10.1111/j.1447-0594.2011.00748.x
  • 査読あり
• [雑誌論文] Novel mechanism of angiotensin II-induced cardiac injury in hypertensive rats: the critical role of ASK1 and VEGF (2012)
  • 著者名/発表者名: Nako H, Kataoka K, Koibuchi N, Dong YF, Toyama K, Yamamoto E, Yasuda O, Ichijo H, Ogawa H, Kim-Mitsuyama S
  • 雑誌名: Hypertens Res 巻: 35 ページ: 194-200
  • DOI: 10.1038/hr.2011.175
  • 査読あり
• [雑誌論文] Amlodipine Enhances Amelioration of Vascular Insulin Resistance, Oxidative Stress, and Metabolic Disorders by Candesartan in Metabolic Syndrome Rats (2012)
  • 著者名/発表者名: Sueta D, Nakamura T, Dong YF, Kataoka K, Koibuchi N, Yamamoto E, Toyama K, Yasuda O, Ogawa H, Kim-Mitsuyama S
  • 雑誌名: Am J Hypertens 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: 10.1038/ajh.2012.26.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Passive exercise using whole-body periodic acceleration enhances blood supply to ischemic hindlimb (2011)
  • 著者名/発表者名: Rokutanda T, Izumiya Y, Miura M, Fukuda S, Shimada K, Izumi Y, Nakamura Y, Araki S, Hanatani S, Matsubara J, Nakamura T, Kataoka K, Yasuda O, Kaikita K, Sugiyama S, Kim-Mitsuyama S, Yoshikawa J, Fujita M, Yoshiyama M, Ogawa H
  • 雑誌名: Arterioscler Thromb Vasc Biol 巻: 31 ページ: 2872-2880
  • DOI: 10.1161/ATVBAHA.111.229773
  • 査読あり
• [雑誌論文] Crucial role of apoptogenic protein in cellular apoptosis and senescense (2011)
  • 著者名/発表者名: Yamamoto E, Yasuda O, Fukuo K, Rakugi H, Ogihara T, Ogawa H
  • 雑誌名: Nihon Ronen Igakkai Zasshi 巻: 48 ページ: 138-141
  • URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21778628
  • 査読あり
• [雑誌論文] Novel mechanism of salt-induced glomerular injury: critical role of eNOS and angiotensin II (2011)
  • 著者名/発表者名: Nakamura T, Kataoka K, Tokutomi Y, Nako H, Toyama K, Dong YF, Koibuchi N, Yamamoto E, Yasuda O, Ogawa H, Kim-Mitsuyama S
  • 雑誌名: J Hypertens 巻: 29 ページ: 1528-1535
  • DOI: 10.1097/HJH.0b013e328348ca95
  • 査読あり
• [雑誌論文] Klotho protein diminishes endothelial apoptosis and senescence via a mitogen-activated kinase pathway (2011)
  • 著者名/発表者名: Maekawa Y, Ohishi M, Ikushima M, Yamamoto K, Yasuda O, Oguro R, Yamamoto-Hanasaki H, Tatara Y, Takeya Y, Rakugi H
  • 雑誌名: Geriatr Gerontol Int 巻: 11 ページ: 510-516
  • DOI: 10.1111/j.1447-0594.2011.00699.x
  • 査読あり
• [雑誌論文] Eplerenone potentiates protective effects of amlodipine against cardiovascular injury in salt-sensitive hypertensive rats (2011)
  • 著者名/発表者名: Nakamura T, Fukuda M, Kataoka K, Nako H, Tokutomi Y, Dong YF, Yamamoto E, Yasuda O, Ogawa H, Kim-Mitsuyama S
  • 雑誌名: Hypertens Res 巻: 34 ページ: 817-824
  • DOI: 10.1038/hr.2011.35
  • 査読あり
• [雑誌論文] 正常血圧者の降圧療法による心血管病二次予防効果 (2011)
  • 著者名/発表者名: 安田修、小川久雄
  • 雑誌名: 血圧 巻: 18 ページ: 1186-1187
  • URL: http://mol.medicalonline.jp/library/journal/abstract?GoodsID=ae6keatd/2011/001812/004&name=1186-1187j&UserID=133.95.81.49
• [雑誌論文] メタボリックシンドローム患者の加齢による血圧変化 (2011)
  • 著者名/発表者名: 安田修
  • 雑誌名: 血圧 巻: 18 ページ: 520-521
  • URL: http://mol.medicalonline.jp/library/journal/abstract?GoodsID=ae6keatd/2011/001806/002&name=0520-0521j&UserID=133.95.81.49
• [雑誌論文] Genetic variants at the 9p21 locus contribute to atherosclerosis through modulation of ANRIL and CDKN2A/B (2011)
  • 著者名/発表者名: Congrains A, Kamide K, Oguro R, Yasuda O, Miyata K, Yamamoto E, Kawai T, Kusunoki H, Yamamoto H, Takeya Y, Yamamoto K, Onishi M, Sugimoto K, Katsuya T, Awata N, Ikebe K, Gondo Y, Oike Y
  • 雑誌名: Atherosclerosis 巻: 220 ページ: 449-455
  • 査読あり
• [雑誌論文] Telmisartan protects against diabetic vascular complications in a mouse model of obesity and type 2 diabetes, partially through peroxisome proliferator activated receptor-γ-dependent activitｙ (2011)
  • 著者名/発表者名: Toyama K, Nakamura T, Kataoka K, Yasuda O, Fukuda M, Tokutomi Y, Dong YF, Ogawa H, Kim-Mitsuyama S
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun 巻: 410 ページ: 508-5313
  • 査読あり
• [学会発表] Apop Gene Expression is Implicated in the Senescence of Vascular Endothelial Cells Induced by High Glucose (2012)
  • 著者名/発表者名: Yasuda O, Yamamoto E, Soejima H, Hanaoka Y, Rakugi H, Kim-Mitsuyama S, Ogawa H
  • 学会等名: 76th Japanese Circulation Society
  • 発表場所: Fukuoka International Congress Center, Fukuoka
  • 年月日: 2012.3.18
• [学会発表] Implication of Apop, a Novel Mitochondrial Protein, in the Mitochondrial Oxidative Stress Production (2011)
  • 著者名/発表者名: Yasuda O, Yamamoto E, Ohishi M, Kim-Mitsuyama S, Rakugi H, Ogawa H
  • 学会等名: 75th Japanese Circulation Society
  • 発表場所: Pacifico Yokohama, Yokohama
  • 年月日: 2011.8.3