研究課題
近年，ncRNA，miRNAを含む機能性RNAが発がん，発生・分化に密接に関与していることを示唆する研究結果が蓄積されつつある．本研究では，最も高頻度に遺伝子変異が検出されているがん抑制遺伝子p53経路の異常が発がん，がんの進展過程におよぼす分子機構を多面的に理解するため，p53によって制御される機能性RNAを最新のゲノム情報を駆使して効率的に同定し，その機能解析へと展開する．さらに発現異常，遺伝子変異の解析，悪性度および化学療法効果との関連性の分析を通じて，胃癌，食道癌を中心とした消化管癌の新しい診断・治療予測システムを開発しようとするものである．（１）p53に制御される機能性RNAの同定 本年度はマイクロアレイから同定した，p53の標的となる新規の機能性RNAの候補として，miR-200ファミリー（miR-200a/200b/429, miR-200c/141）に着目した．これら5つのmiRNAが外来性p53 familyおよび内在性p53の活性化により発現上昇することを明らかにした．p53を活性化した際のChIPシークエンス（H3K4me3, H3Ac）によってもこれらのmiRNAの転写活性化が見られた．さらに2つのクラスター近傍にp53結合配列を同定し，クロマチン免疫沈降，レポーターアッセイにより，p53応答性配列であることを明らかにした．（２）miR-200ファミリーの機能解析 miR-200ファミリーの導入により，胃癌細胞株MKN45, AZ521の増殖能，遊走能が上昇することを明らかにした．miR-200b/200c/429の新規標的として，CRKL (v-crk sarcoma virus CT10 oncogene homolog-like)を同定した．臨床検体の解析から，CRKL遺伝子発現が胃癌組織で上昇し，予後不良と相関することを明らかにした．
2: おおむね順調に進展している
本年度はマイクロアレイ，およびChIPシークエンスによって同定したp53の標的miRNA候補，miR-200ファミリー（miR-200a/200b/429, miR-200c/141）について解析を行った．外来性，および内在性p53によりmiR-200ファミリーの発現が上昇することをqRT-PCRにより確認した．さらにこれらmiRNAクラスター近傍にp53結合配列を同定し，p53 familyによって転写活性化されることを明らかにした．また，miR-200ファミリーの新規標的としてCRKLを同定し，消化器癌の予後不良因子であることも明らかにした．これらの結果より，p53がmiR-200ファミリーに転写制御を介してCRKLの発現を抑制し，癌の進展を制御していることが示唆され，計画通りの成果が得られた．
p53の新規標的miRNA，miR-200ファミリー（miR-200a/200b/429, miR-200c/141）についての研究は順調に進展しており，今後，消化器癌組織におけるmiR-200ファミリーの発現の解析，予後や悪性度との関わりを検討する予定である．具体的には，正常組織，癌組織における発現パターンをISH法，qRT-PCR法を用いて定量的に評価し，臨床病理学的因子や治療反応性との相関を検討する．さらに今回同定したmiR-200ファミリーの新規標的CRKLの機能解析を加え，成果発表，特許取得をする予定である． またmiR-200ファミリー以外に，p53の新規標的miRNA，機能性RNAの候補が得られている．今後これらについても，p53による転写様式，癌組織での発現，機能解析等を通じて消化器癌関連機能性RNAの同定を目指したいと考えている．
次年度もp53の新規標的miRNA，miR-200ファミリーと，その標的CRKLの発現解析，機能解析を継続し，その成果を早期に発表したいと考えている．それに加え，miR-200ファミリー以外のp53の新規標的miRNA，機能性RNAの解析に着手する．マイクロアレイ，およびChIPシークエンスによるスクリーニングをすでに行っていたため，次年度に繰り越す研究費が生じた．すでに同定しているmiR-200ファミリーを含む消化器癌関連機能性RNAとその標的について，次年度は新たに血漿（または血清）中の定量解析システムの構築を試み，がん診断・治療のバイオマーカーとしての有用性の検討を開始する予定である．次年度の研究費の使用計画設備備品費 なし消耗品費 発現解析のための試薬類（酵素類31万円，RNAプローブ30万円，抗体40万円，オリゴ40万円），細胞培養器具・試薬30万円学会発表旅費20万円，謝金30万円，印刷費10万円
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J Biol Chem
巻: 287 ページ: 12975-84
10.1074/jbc.M111.321828
J Gastr oenter ol
巻: 46 ページ: 143-152
10.1007/s00535-010-0320-7
Cancer Prev Res
巻: 4 ページ: 674-83
10.1158/1940-6207.CAPR-10-0214
Cancer Res
巻: 71 ページ: 5646–58
10.1158/0008-5472.CAN-11-1076
巻: 71 ページ: 7038-47
10.1158/0008-5472.CAN-11-1053
