研究課題
本研究では，がん抑制遺伝子p53経路の異常が発がん，がんの進展過程におよぼす分子機構を多面的に理解するため，p53ファミリーによって制御される機能性RNAを同定し，その機能解析へと展開する．さらに発現異常，悪性度および化学療法効果との関連性の分析を通じて，消化管癌の新しい診断・治療予測システムを開発しようとするものである．（１）miR-200ファミリーの新規標的遺伝子CRKLの機能解析前年度に同定した，p53誘導性miRNA，miR-200b/200c/429の新規標的遺伝子CRKL (v-crk sarcoma virus CT10 oncogene homolog-like)について解析をすすめた．CRKL遺伝子の3’-UTRにmiR-200b/200c/429の結合配列を同定し，p53ファミリーがmiR-200b/200c/429を転写活性化し，この配列を介してCRKLの発現を抑制していることを明らかにした．臨床検体の解析から，CRKL遺伝子発現が胃癌組織で上昇し，予後不良と相関することをつきとめた．また，p53変異のある症例で有意にCRKLが発現上昇していた．CRKLの導入により，胃癌細胞株の増殖，浸潤，遊走能が上昇することを明らかにした．以上の結果から，p53ファミリーがmiR-200b/200c/429の転写誘導を介してCRKLの発現を制御し，がんの浸潤，転移能を抑制していることが示唆された．（２）p53に制御される新規機能性RNAの同定マイクロアレイ，およびp53結合コンセンサス配列の全ゲノム網羅的解析より，76のp53誘導性ncRNA候補を同定した．それらすべてについて，RT-PCR法によりp53ファミリーによる発現誘導を確認したところ，6つのncRNAの強い転写誘導が認められた．さらに6つのncRNAすべてについて近傍のp53応答性配列を同定した．
2: おおむね順調に進展している
平成24年度はp53ファミリーの標的miRNA，miR-200ファミリー（miR-200a/200b/429, miR-200c/141）の機能解析を行った．外来性，および内在性p53によりmiR-200ファミリーが直接転写活性化されることをqRT-PCR，クロマチン免疫沈降，レポーターアッセイにより確認した．また，miR-200ファミリーの新規標的としてCRKLを同定し，消化器癌の予後不良因子であることも明らかにした．さらにCRKLが消化器癌細胞の増殖，浸潤，遊走能を促進することをはじめて明らかにした．これらの結果より，p53がmiR-200ファミリーに転写制御を介してCRKLの発現を抑制し，癌の進展を制御していることが示唆された．これらの成果に加えて，6つのp53ファミリーの新規標的ncRNAを同定し，平成25年度に発現異常，遺伝子変異の解析，悪性度および化学療法効果との関連性の分析する予定であり，計画通り研究が進展している．
miR-200ファミリー（miR-200a/200b/429, miR-200c/141）の標的遺伝子CRKLについての研究は順調に進展しており，CRKLが消化器癌細胞の増殖，浸潤，遊走能を促進することをはじめて明らかにした．消化器癌組織おける発現解析においても，CRKL遺伝子発現が胃癌組織で上昇し，予後不良と相関することをつきとめた．今後，症例数を増やして消化器癌組織におけるCRKLの遺伝子発現の解析を行うとともに，正常組織，癌組織における発現パターンをISH法，または免疫染色法で評価し，臨床病理学的因子や治療反応性との相関を検討する．さらに平成24年度に同定したp53の新規標的ncRNAの解析に着手する予定である．具体的にはp53による転写様式，癌組織での発現，機能解析等を通じて消化器癌関連機能性RNAの同定を目指したいと考えている．
平成24年度は順調に研究が進展したため，研究補助に対する人件費，謝金を必要としなかった．そのため13万余りの残額が生じ，次年度の研究進展に活用したい．次年度もCRKLの発現解析，機能解析を継続し，研究を進展させたい．その成果を第72回日本癌学会学術総会で発表し，原著論文での発表，特許取得を予定している．それに加え，miR-200ファミリー以外のp53ファミリーの新規標的miRNA，機能性RNAの解析に着手したいと考えている．すでに6つのp53ファミリーの新規標的ncRNAを同定しており，それらを含む消化器癌関連機能性RNAとその標的について，新たに血漿（または血清）中の定量解析システムの構築を試み，がん診断・治療のバイオマーカーとしての有用性の検討を開始する予定である．次年度の研究費の使用計画設備備品費 なし消耗品費 発現解析のための試薬類（酵素類30万円，RNAプローブ30万円，抗体38万円），学会発表旅費10万円，謝金10万円，印刷費5万円
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