| 研究課題/領域番号 |
23590977
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
山本 和秀 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (90140491)
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| 研究分担者 |
能祖 一裕 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 准教授 (10314668)
白羽 英則 岡山大学, 大学病院, 講師 (40379748)
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| 研究期間 (年度) |
2011-04-28 – 2014-03-31
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| キーワード | iPS細胞 / 疾患モデル / 細胞治療 |
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| 研究概要 |
本研究では、マウス尾細胞からiPS細胞を作成し、これを肝細胞へ分化誘導したうえで急性または慢性肝不全モデルに自家移植し、各種の評価を行うことを最終目的とする。これを達成するため、１）ウイルスベクターキットを用いたマウス尾細胞からのiPS細胞の作成･品質評価、２）急性および慢性肝不全モデルマウスの作成を平成23年度に実施予定であった。１）マウス尾細胞からのiPS細胞の作成･品質評価について、まず任意のマウス尾切片より線維芽細胞を抽出し、これを安定して培養する方法を確立した。次いで、4種類のリプログラミング因子(Lin28、NANOG、SOX2、OCT4)と、レポーターとして GFP 遺伝子を組み込んだ環状DNAであるminicircle DNA(システムバイオサイエンス社製)を、マウス尾細胞に電気穿孔法で形質導入し、蛍光活性化セルソーターで抽出したうえでさらに細胞化学薬品による形質導入を行い、iPS細胞の作出作業を行っている。また、4種類のリプログラミング因子(cMyc、NANOG、SOX2、OCT4)をもつ市販のレンチウイルスベクター(システムバイオサイエンス社製)を用い、iPS細胞の作成作業を行っている。これらはいずれも実験が進行中であり、条件設定を行っている状況である。２）急性および慢性肝不全モデルマウスの作成については、障害肝の再生を防ぐため、アルカロイド系薬剤であるレトロルシンを事前投与し、四塩化炭素を8週間(2回/週)連続投与し、慢性肝不全モデルを作成した。このモデルマウスでは、アンモニア値上昇、腹水などの肝不全症状がみられ、組織標本でも肝線維化が確認でき、疾患モデルマウスとして妥当であると考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
マウス尾細胞からのiPS細胞の作成について、１）4種類のリプログラミング因子(Lin28、NANOG、SOX2、OCT4)と、レポーターとして GFP 遺伝子を組み込んだ環状DNAであるminicircle DNA(システムバイオサイエンス社製)、２）4種類のリプログラミング因子(cMyc、NANOG、SOX2、OCT4)をもつ市販のレンチウイルスベクター(システムバイオサイエンス社製)を用い、iPS細胞の作成作業を行っているが、いずれも実験が進行中であり、条件設定を行っている状況である。iPS細胞コロニーが得られるよう、実験を重ねて至適条件を検索している。また肝不全モデルマウスの作成については、部分肝切除を行い急性肝不全モデルを作成する予定であったが、アルカロイド系薬剤であるレトロルシンを事前投与したうえで部分肝切除を行っても、肝不全症状を惹起することができなかった。急性肝不全モデルの作成について、別の方法を検討中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
上述の通り、マウス尾細胞からのiPS細胞の作成については2種類の形質導入方法を用いた実験が進行中であり、条件設定を行っている状況である。iPS細胞コロニーが得られるよう、実験を重ねて至適条件を検索していく予定である。また、急性肝不全モデルの作成について、他家の報告を渉猟し、方法を検討中である。24年度の実験計画としては、さらに以下の実験を予定している。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
肝不全モデルマウスへの分化肝細胞の投与方法を検討するための予備実験として、理研細胞バンクよりマウスiPS細胞(京都大学にて樹立された4株、雄マウス由来)の提供を受け、われわれが開発した肝細胞分化誘導方法を用いて肝細胞へ分化させる。分化誘導としてはまず浮遊培養にて胚様体を形成し、その後アクチビンA(100ng/ml)および塩基性線維芽細胞増殖因子(100ng/ml)を用いて胚体内胚葉を誘導、さらに肝細胞増殖因子(100ng/ml)、デキサメサゾン(40ng/ml)を用いて肝細胞へと誘導する。得られた肝細胞の品質評価として、アルブミンをはじめとする肝細胞特異的遺伝子をPCR法にて検出するほか、アルブミン産生能、尿素合成能、アンモニア除去能、フィブリノーゲン産生能、薬物(リドカインなど)代謝能、リファンピシンやフェノバルビタールによるCYP誘導能を測定する。得られた肝細胞を免疫不全マウス(SCIDマウス、雌)へ脾臓経由で移植し、移植より4～12週後に肝を摘出し、組織標本にてマウス肝内のY染色体を検出する(FISH法)ことで、iPS細胞由来幹細胞の肝への生着性を評価する。また脾臓および肝臓内の奇形腫形成の有無をみることで安全性を評価する予定である。
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