| 研究課題/領域番号 |
23590977
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
山本 和秀 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (90140491)
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| 研究分担者 |
能祖 一裕 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 准教授 (10314668)
白羽 英則 岡山大学, 大学病院, 講師 (40379748)
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| キーワード | iPS細胞 / 肝細胞 / 肝不全 / 再生医療 / 細胞移植 |
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| 研究概要 |
本研究では、マウス尾細胞からiPS細胞を作成し、肝細胞へ分化誘導したうえで肝不全モデルに自家移植し、各種の評価を行うことを最終目的とする。これを達成するため、１）マウス尾細胞からのiPS細胞の作成･品質評価、２)マウスiPS 細胞の肝細胞分化、３）分化細胞のマウスへの移植を平成24年度内に実施予定であった。
１）まず任意のマウス尾切片より線維芽細胞を抽出し、培養する方法を確立した。次いで、4種類のリプログラミング因子をもつminicircle DNAおよびレンチウイルスベクター(いずれもシステムバイオサイエンス社製)を用い、iPS細胞の作成作業を行ったが、iPS細胞の樹立に至らなかったため、京都大学で確立されたレンチウイルスベクター(アッドジーン社製)法を採用し、条件設定を行っている状況である。
２）iPS細胞から胚様体を形成し、その後胚体内胚葉を経てマウスiPS細胞由来肝細胞を作成した。得られた細胞について、RT-PCR法、定量PCR法にて肝細胞に特異的な遺伝子の発現を確認し、電子顕微鏡およびPAS染色でグリコーゲン貯蔵能があることを確認した。またアルブミン産生、尿素合成、アルファ-1アンチトリプシン産生、ハプトグロビン産生能を有していることを確認した。以上より、マウスiPS細胞から肝細胞に類似した遺伝子発現、代謝機能をもつ細胞を得た。これらの結果については、一部をBiomed Eng Online誌(Iwamuro M, et al. 2012)に発表した。
３）上記のマウスiPS細胞由来肝細胞を用いて、SCIDマウスに門脈経由で細胞移植を行った。しかしながら12週間後の時点で奇形腫の形成があり、分化誘導の最終段階においても未分化細胞が残っている可能性が示唆された。奇形腫形成の危険性を除去し、細胞移植の安全性を高めるため、分化誘導方法の改善を行っている状況である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
マウス尾細胞からのiPS細胞の作成について、１）4種類のリプログラミング因子(Lin28、NANOG、SOX2、OCT4)と、レポーターとして GFP 遺伝子を組み込んだ環状DNAであるminicircle DNA(システムバイオサイエンス社製)、２）4種類のリプログラミング因子(cMyc、NANOG、SOX2、OCT4)をもつ市販のレンチウイルスベクター(システムバイオサイエンス社製)を用い、iPS細胞の作成作業を行ったが、iPS細胞の樹立に至らなかった。京都大学で確立されたレンチウイルスベクター法(パッケージング細胞であるPLAT-E細胞およびアッドジーン社製プラスミドを使用)を採用し、条件設定を行っている状況である。iPS細胞コロニーが得られるよう、実験を重ねて至適条件を検索している。
分化肝細胞をSCIDマウスに移植したところ奇形腫形成を認めた。分化細胞の安全性を高めるため、奇形腫形成を生じないよう分化誘導方法の改良を行う予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
マウス尾細胞からiPS細胞を樹立するため、京都大学で確立されたレンチウイルスベクター(アッドジーン社製)法を採用し、条件設定を行う。その後に各個体(免疫不全ではないマウス)からiPS細胞を作成する。
iPS細胞から浮遊培養にて胚様体を形成し、その後胚体内胚葉を誘導、さらに肝細胞へと誘導し、マウスiPS細胞由来肝細胞を作成したが、奇形腫形成がみられた。このため分化誘導方法の改善を行い、奇形腫形成がない、もしくは奇形腫形成リスクがより少ない方法の確立を目指す。
以上の実験にて成果が得られたのち、ウイルスベクターを用いてマウス尾細胞からiPS 細胞を作成し、このiPS 細胞を肝細胞へと分化誘導したのち、肝不全を惹起したモデルマウスへと自家移植する。このマウス自家移植系において、①肝機能が改善するか、②生存率が向上するか、③安全性(拒絶反応や奇形腫形成など)の面で問題がないか、等を評価したい。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
iPS細胞樹立実験に際し、レンチウイルスベクター(アッドジーン社製)およびPLAT-E細胞を購入する。またiPS細胞の肝細胞分化誘導法の改善を行うため、各種の増殖因子、化合物を購入し、条件設定を行う。また得られた肝細胞の評価のため、PCR用プライマー、ELISAキットなどを購入する予定である。
なお、平成24年度に研究費を効率的に使用し、残額として1,168円が発生した。この繰越金も含めて上記研究に支出する計画である。
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