| 研究課題/領域番号 |
23590996
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| 研究機関 | 愛知医科大学 |
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研究代表者 |
米田 政志 愛知医科大学, 医学部, 教授 (30261407)
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| 研究分担者 |
中尾 春壽 愛知医科大学, 医学部, 教授 (60326139)
中出 幸臣 愛知医科大学, 医学部, 講師 (70431400)
シバスンダラン カルナン 愛知医科大学, 医学部, 助教 (30557096)
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| 研究期間 (年度) |
2011-04-28 – 2014-03-31
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| キーワード | NASH / 肝発癌 / オリゴＣＧＨアレイ / コリン欠乏食 |
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| 研究概要 |
非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）および肝脂肪化を伴うウイルス性肝炎からの発癌メカニズムを検討するため、本年はＮＡＳＨ肝発癌モデルであるコリン欠乏アミノ酸食を用いて、脂肪性肝炎から肝硬変を誘導し、前がん病変および肝発がんの状況を確認した。５週齢雄性Wistarラットにコリン欠乏アミノ酸食（choline-deficient L-amino acid-defined diet:CDAA食）を投与し、ＮＡＳＨより肝硬変を経て肝発癌にいたるモデルを作成する。対照食としてコリン添加アミノ酸食（ＣＳＡＡ）を用い、ＣＤＡＡ食およびＣＳＡＡ食は自由摂食とした。ＣＤＡＡ食およびＣＳＡＡ食の投与開始６、12、２４および４８週目に各々の群でラットを安楽死させて、肝および血液を採取し、血清中性脂肪量および血清ＡＬＴ値を測定した。さらに肝硬変、肝前癌病変および肝発がんを組織学的検討にて評価した。その結果、ＣＳＡＡ食投与群では血清ＡＬＴ値および血清中性脂肪量には変化を認めなかったが、ＣＤＡＡ食投与により血清ＡＬＴ値および血清中性脂肪量は２４および４８週と経るに従い増加した。肝組織学的検討では、ＣＳＡＡ食投与では変化を認めなかったが、ＣＤＡＡ食投与開始２４週目に肝硬変にいたり、さらにＣＤＡＡ食投与開始４８週目には肝硬変はさらに増悪した。前癌病変のマーカーであるＧＳＴ－Ｐ陽性細胞数を定量したところＣＤＡＡ食投与群では投与期間を経るに従い増加し、ＣＤＡＡ食投与開始４８週目には半数のラットに肝発癌を認めた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成２３年度の計画では肝発がんモデルを作成することであった。ＣＤＡＡ食を投与することで、前癌病変数は増加し、肝発癌を半数のラットに認められたことから、次年度への研究計画への移行を図ることができるものと考えられた。
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| 今後の研究の推進方策 |
ＣＳＡＡ食およびＣＤＡＡ食投与開始後、６、１２、２４および４８週後に得られた肝組織よりRNeasy Mini Kitを用いてRNAを抽出し、得られたＲＮＡよりｃＤＮＡに逆転写する。さらにAgilent社のWhole Rat Genome CGHマイクロアレイを用いてＣＤＡＡ食群を赤色蛍光色素（Cy3)でＣＳＡＡ食群を緑色蛍光色素（Cy5)で標識し、スライドグラス上のプローブとハイブリダイズさせる。スライドグラスを洗浄後、蛍光シグナル強度を測定する。Cy3およびCy5の蛍光シグナル測定および得られた測定値の分析はFeature Extractionソフトウエアを用いて、遺伝子をリストアップする。さらにResolverソフトウエアを用いて、ＣＤＡＡ群がＣＳＡＡ群に比べ遺伝子発現が増減しているかを対数表示で定量し、発癌過程において変化している遺伝子の探索をおこない、前癌病変数との相関関係を検討する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
平成２４年度はＣＤＡＡ食およびＣＳＡＡ食投与ラットより得られた肝よりＲＮＡを抽出しマイクロアレイを施行するために使用する以下の物品を購入する予定である。TRIzol reagent (Invitrogen)、RNeasy Mini Kit (Qiagen)、cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems)、RNase-free DNase Digest Set (Qiagen)、SurePrint G3 Rat GE microarray Kit 8×60K (Agilent technology)、Low RNA Input Linear Amp Kit (Agilent technology)、Agilent Gene Expression Hybridization Kit (Agilent technology)、Agilent’s Microarray Scanner system (Agilent technology)、Agilent feature extraction software (FES)、Rosetta Resolver gene expression data analysis system (Rosetta Biosoftware)
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