研究課題
細胞運動機能の引き金となるミオシンのリン酸化は、ミオシンリン酸化酵素(MLCK)とミオシン脱リン酸化酵素(MLCP)の相対的酵素活性バランスにより制御を受けている。ミオシンリン酸化の新たなメカニズムとして同定された、MLCPの一分子であるMYPT1の新たな結合蛋白質のp116Ripは、RhoA、MLCPと結合することによって、RhoAを不活化しMLCP活性を上昇させ、その結果として細胞内のミオシンのリン酸化を抑制的に制御していた。p116Ripは平滑筋や脳、肺に発現していることが報告されていることから、肺由来のヒト繊維芽細胞（HFL-1)及び、ヒト気道上皮細胞（HBEC-3)の培養細胞のみならずヒト平滑筋細胞(ASMc)を用いてp116Ripのタンパク発現の検討を特異的抗体を使用したウエスタンブロット法にて行った。さらにp116Ripに対する特異的siRNAを使用してHFL-1及び、HBEC-3、ASMc細胞内におけるp116Ripのgene silencingの検討を行った。いずれの細胞株においてもp116Ripが発現しており、かつp116Rip siRNAを用いる事によって特異的に効率よくp116Ripの蛋白発現がknock downされることが判明した。そして、p116Ripのgene silencingに伴い、ミオシンのリン酸化が上昇している事もウェスタンブロット法により判明した。In vitroだけでなくin vivoにおいてのp116Ripの役割を解明するために、p116Ripの全身過剰発現型モデルマウス（トランスジェニックマウス）の作製を行い、現在のところマウスの繁殖を行っている。今後、数を増やして誕生するマウスのphenotypeを解析し、それらマウスを使用してブレオマイシンマウスに及ぼす影響をwild typeと比較検討して行く予定である。
2: おおむね順調に進展している
培養細胞を使用した実験では予定していた実験を進めている状況であるが、トランスジェニックマウスの実験では週齢数を合わせブレオマイシンマウスを作成する実験を今後、時間をかけて進めていくところである。マウスを使用した実験は元々時間のかかる作業であり、かつ培養細胞よりも予想できない進展状況となるため、in vivoの実験系に関しては予想された範囲内の進展状況と思われる。
今後は、週例数のそろったブレオマイシンマウスに対しては肺胞洗浄液や肺組織を使用してのサイトカインや線維化の度合いに対する影響を検討していく。しかしながら、動物モデルマウスを使用したin vivoの実験系は予定通りに進まない事も多くかつ、時間がかかるため、培養線維芽細胞、平滑筋細胞を使用してgene silencingを行いながらTGF-betaなどの刺激を加えて培養細胞からの炎症性サイトカインの分泌に及ぼす影響を検討し、in vitroでの解析も同時に進めていく予定である。
動物モデルを使用した実験系では複数年度にわたる長期的な実験計画が必要であり、本研究においても次年度に動物モデルマウスを使用した詳細な検討が今後実施可能な状況となっていく。そのため次年度は、1,700,000円の研究費を申請しており、培養細胞・トランスジェニックマウスの維持とそれらを使用した実験、サイトカイン分泌、mRNAレベルでのシグナル伝達タンパク質の解析、同タンパク質リン酸化レベルでのシグナル解析に重点を置いて研究を進めていく予定である。リン酸化レベル測定のためのタンパク質泳動装置や、各種抗体、ELISA kitや試薬などの消耗品の購入に使用する。
すべて 2011
すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 3件)
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