2012 年度実施状況報告書

Ｇ蛋白質共役受容体アレイを用いた新規肺癌標的分子の探索

研究課題

研究課題/領域番号	23591155
研究機関	福島県立医科大学
研究代表者	横内浩福島県立医科大学, 医学部, 講師 (60399946)
キーワード	国際情報交換 / 米国
研究概要	【具体的内容】肺癌にて手術を行った患者を合計120名から135名に増やして肺癌組織および隣接する正常組織におけるGPCR（G蛋白共役受容体）の発現レベルを比較検討した。その結果、癌細胞表面で高発現かつ正常組織で低発現もしくは発現していないGPCR分子を3分子、癌細胞で発現が全く認められず、正常組織で高発現しているGPCR下流の細胞質内アダプター分子1分子を同定した（分子名は現段階で公表できず）。該当する癌高発現3分子のうち1分子のポリクローナル抗体にて免疫染色を行い、アレイデータにおけるRNAレベル同様、肺癌細胞、特にcancer nest（癌胞巣）の周囲浸潤部分（invasive front)で高い発現を示し、同分子が癌浸潤能に関連している可能性が示唆された。また正常組織ではほとんど発現が認められなかった。現在臨床的パラメーター（術後無再発期間、全生存期間、組織別など）との照合を進めており、今年11月の第54回日本肺癌学会総会で発表するとともに、抄録締切である5月20日に合わせて英語論文化を開始する予定である。また他の3分子についても同様の免疫染色を施行した。しかし最適な免疫染色条件が決定できず、positive control及びnegative controlの細胞株をセルブロック化して現在染色条件を検討中である。【意義】正常組織と比較して肺癌に高い発現を示す、もしくは発現の全く認められないGPCR, GPCR関連分子を同定することができた。そのうち1分子は肺癌浸潤能に関連することが示唆された。【重要性】浸潤能やアポトーシスとの関連を見出すことができれば、これまで報告のなかった本研究において見出した分子に対する標的治療の化学療法への相加効果への期待が高まると考えられる。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由検討対象となった肺癌患者を120名から135名に増やし、同定された4分子のうち、1分子では、免疫染色を完遂し、その結果cancer nestのinvasive frontで強発現することが明らかとなり、浸潤能を示唆することが示された。これまで同分子は肺癌での発現そのものの報告がなく、貴重な結果と思われる。臨床情報との照合を行ったのち近日中の論文作成、学会発表が可能と考える。一方で、他の3分子の免疫染色条件が決定されておらず、in vitroによる細胞株での研究で、同定された分子特異的agonist, antagonistを用いてもELISA assayによるapoptosisの進行もしくは制御といったphenotypeはこれまで認められていない。分子の機能解析において検討の余地がある。
今後の研究の推進方策	135名の肺癌患者における免疫染色が終了した1分子においては、臨床情報（性別、年齢、喫煙歴、組織型、術後無再発生存期間、全生存期間など）と照合し、同分子との関連をSPSSを用いた統計解析にて検討する。またin vitroにおいて浸潤能を有するか、同分子を高発現する細胞株とSiRNAにて同分子をknock downした細胞におけるマトリゲルアッセイを行う。他の3分子については更なる免疫染色の条件検討を行い、上記分子と同様の検討を行う一方、特異的agonist, antagonistによる細胞のphenotype同定のために、再度ELISA assayにてapoptosisの誘導や制御が見出されないか条件を変更して施行する。期待されるapoptosis関連データが検出された場合、関連シグナル伝達経路をcAMP下流のPKA, Epac, PI3K/Aktの特異的agonist, antagonistを用いてELISA assayやWestern Blottingにて確認する。
次年度の研究費の使用計画	次年度の研究費使用計画は以下の通りである。1. 免疫染色用：免疫染色用kit (ヒストファインシンプルステイン） 15万円、DAB基質キット 8万円、一次抗体 20万円、2. 浸潤能研究用：マトリゲルインベージョンチャンバー 5万円、SiRNA関連 10万円、3. アポトーシス関連：ELISA assay 12万円、4. 細胞培養用一般試薬：細胞培養用培地、血清、抗生剤、トリプシン、ピペットなど 10万円、6. 学会出張旅費：日本肺癌学会総会 5万円、6. その他：周囲備品（copy、印刷用備品、文房具など）15万円