| 研究課題/領域番号 |
23591170
|
|---|
| 研究機関 | 久留米大学 |
|---|
研究代表者 |
桑野 剛一 久留米大学, 医学部, 教授 (60215118)
|
|---|
| 研究分担者 |
木田 豊 久留米大学, 医学部, 講師 (30309752)
谷 健次 久留米大学, 医学部, 助教 (00614108)
|
|---|
| キーワード | 塩基性抗菌ペプチド / 抗菌活性 / 過酸化水素 / 活性酸素 / 膜透過性 / ヒドロキシラジカル |
|---|
| 研究概要 |
細菌感染症において、非特異的感染防御機構の一つとして塩基性抗菌ペプチドが重要であることは広く知られている。その特徴は、抗菌スペクトルが広く、また薬剤耐性菌にも抗菌活性を示すことにある。しかし、その抗菌作用機序は、膜透過性亢進の関与が考えられているが、完全に解明されていない。ところで、近年、β-ラクタム、キノロン薬剤等の抗菌剤による細菌細胞死の機序として、SOS反応、酸化反応由来のhydroxyl radical等の関与が示唆されている。
そこで、本研究において、抗菌ペプチドによる細胞死の誘導機構を膜透過性、活性酸素、細胞内反応シグナル等の観点から解明し、抗菌ペプチドの活性を増強する方法を探り、臨床的に感染症治療の効率化を図る基盤的なデータを得ることを目的とする。
前年度、抗菌ペプチドの抗菌活性と膜透過性亢進が概ね相関することを見出した。しかし、一部の抗菌ペプチドは、膜透過性亢進を示さなかったが、強い抗菌活性を示した。さらに、ペプチド処理により過酸化水素が産生誘導されることを観察した。
今年度、抗菌活性機構について、さらなる解析を加えた。活性酸素の中でもとりわけ、hydroxyl radicalの酸化作用が最も強いことが知られており、そこで、hydroxyl radicalの検出、およびその酸化産物である8-OHdGの検出をおこなった。抗菌ペプチド処理後、両者を検出することができた。この結果から、抗菌ペプチドによる抗菌活性発現には、hydroxyl radicalの関与が強く示唆された。次に、hydroxyl radicalの除去剤存在下に抗菌アッセイを行ったところ、20から50％程度の抗菌活性の阻害を認めることができた。
これらの結果から、抗菌ペプチドには、膜透過性亢進による抗菌作用に加え、hydroxyl radicalによる抗菌活性が存在することが明らかとなった。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今年度、抗菌活性機構の中でも、活性酸素による標的細胞の傷害機構の解析を重点的に行った。その成果として、活性酸素の中で安定的で検出が容易とされる過酸化水素の誘導の検出に加えて、酸化作用が強いhydroxyl radicalの検出をも行うことができた。また、hydroxyl radicalの酸化物である8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG)の存在も確認した。これらの結果から、抗菌ペプチドによる活性酸素依存的な抗菌活性発現には、hydroxyl radicalの関与が強く示唆された。そこで、次に、hydroxyl radicalの除去剤（チオウレア、鉄キレート剤2.2'-bipyridyl）存在下に抗菌アッセイを行ったところ、大腸菌、マイコプラズマ等を標的細胞として、20～50％程度の抗菌活性の阻害を認めることができた。これらの結果から、抗菌ペプチドには、膜透過性亢進による抗菌機構に加え、活性酸素であるhydroxyl radicalによる抗菌機構が存在することが明らかとなった。
また、これらの結果で注目すべきは、膜透過性を亢進しなかった抗菌ぺプチドは、hydroxyl radicalによる抗菌機構をもつことが明らかとなった。その他の抗菌ペプチドは、膜透過性誘導、hydroxyl radicalによる二つの抗菌機構を有することが示唆された。アミノ酸の配列の違いにより異なる抗菌機構をもつことは非常に興味深い。
以上より、抗菌ペプチドには新たなhydroxyl radical依存的な抗菌機構が存在することが明らかとなり、ここまでのデータを纏めて現在、論文を作成中であり、２年目の研究計画はほぼ予定どおり達成されたと自己評価できる。
|
| 今後の研究の推進方策 |
本研究の成果から、抗菌ペプチドの抗菌機構には膜透過性依存的、および活性酸素依存的な二つが存在することが明らかとなった。そして、抗菌ペプチドの配列により、活性酸素依存性抗菌機構のみを有する抗菌ペプチドと膜透過性依存性、および活性酸素依存性を同時に有する抗菌ペプチドが存在することは興味深い。
今後さらに、分子レベルでの抗菌機構の解析を進めたい。即ち、ストレスで誘導されるSOS反応について、検討を実施する。抗菌ペプチド処理細菌のrecA，lexAをmRNAレベルでRT-PCR等によって解析する。DNA修復タンパクhex, rad等についても同様に解析する。また、RecAの活性化ではATP加水分解が生じることから、リン酸モリブデン青色測定法でATPase 活性を測定する。このような解析から、抗菌ペプチド処理による細菌の細胞死誘導における活性酸素依存的抗菌機構が解明されることが期待できる。
また、活性酸素依存的抗菌機構においては、hydroxyl radicalが重要な役割を果たしていることから、hydroxyl radicalの発現制御の解明が重要な課題である。とりわけ、鉄の関与が重要であり、鉄濃度とhydroxyl radicalの発現についても検討したい。また、ラジカル補足型抗酸化物であるビタミンＣ，Ｅ等の抗菌活性への影響を調べたい。
ところで、抗菌ペプチドがin vivoでどのような抗菌機構を発現するか検証することは非常に重要な課題である。また、このような抗菌機構は一般のキノロン等の抗菌剤においても観察した。この事実は非常に興味深く、実際、in vivoで発現する抗菌剤の抗菌機構については解明されておらず、それを明らかにすることは、臨床における感染症の治療の効率化にもつながり非常に重要な課題である。
|
| 次年度の研究費の使用計画 |
次年度（平成25年度）の直接経費は、平成24年度の繰越直接経費を加えて、199万円である。平成25年度は研究計画の最終年度にあたる。実験研究の基盤となる抗菌ペプチドが少なくなってきたため、抗菌ペプチド合成費用を45万円計上する。過酸化水素、SOD、カタラーゼ等の活性酸素等の検出に関わるキット費用として、30万円を計上したい。次に、抗菌ペプチドにより誘導されるストレスで生じるDNAの酸化損傷を8-OHdGをマーカーとしてELISAキットで検出する予定である。本キットは、１セット8.5万円であり、2セットほどの購入を予定しており、合計17万円となる。また、酸化損傷生成物であるチミジングリコールを検出するため、抗チミジングリコール抗体（6万円）、抗8-ニトログアシノン抗体（6万円）を購入する。脂質酸化ストレスの評価に、ヘキサノイルリジン測定ELISAキット（15万円）を購入する。さらにタンパク質の酸化損傷を抗ジチロシン抗体（5万円）で検出したい。これらの抗体を検出する試薬一式費用として、20万円を見込んでいる。ラジカル補足型抗酸化物であるビタミンＣ，Ｅ等の抗菌活性への影響を検証する実験で、ビタミンＣ，Ｅ等の試薬（4万円）を購入する。
また、ストレスで誘導されるSOS反応についても検討を予定している。抗菌ペプチド処理細菌のrecＡ，lexAをmRNAレベルでRT-PCR等によって解析する予定であり、プライマー作製、RNA抽出、PCRに関わる試薬等の費用で、30万円を予定している。最後に、細菌の培養等に関わる試薬、消耗品一式として、21万円を予定している。
以上の物品費の総合計199万円を本年度の予算として計画している。
|
