ヒト腎臓細胞由来ｉＰＳ細胞による次世代人工腎臓作成の試み

2011 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 23591183
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 菱川 慶一 東京大学, 医学部附属病院, 特任准教授 (50255460)
• 研究期間 (年度): 2011-04-28 – 2014-03-31
• キーワード: iPS細胞 / 再生医療 / マイクロアレイ

研究概要

平成２３年度は以下の手順で研究を実施した。ヒト腎臓細胞由来iPS細胞の樹立１、ウイルス産生：山中４因子を導入する為にPlat-E細胞に４因子のベクターとpSVGL-1をtransfectionし、４８時間御に得られたウイルスを回収する。２、遺伝子導入：Polybrene 4μg/mlの存在下で、２４時間ウイルス液中でヒト腎臓細胞を培養し、４因子を導入する。遺伝子を導入したヒト腎臓細胞は６日間維持培養用の培地で培養し、６日目にMEF (mouse embryonic fibroblast)へ播種し、その後ES細胞用培地で培養する。３、コロニー選択：一日おきに培地を交換し、１４－２１日コロニー形成を観察し、メサンギウム細胞、近位尿細管細胞それぞれから２４コロニーを選択する。４、クローンの選択：得られたクローンのコロニーの未分化能を確認するため、ALP、Oct、Nanog、SSEA-3、SSEA-4、TRA1-60、TRA1-81の染色を行う。２４コロニーのうち、染色が良好なクローンを１２個ずつ選択する。５、未分化能の確認：選択したクローンの未分化能をPCR(Oct, Nanog, Rex-1)、FACS (Oct,SSEA-3、SSEA-4、TRA1-60、TRA1-81)で評価し、メサンギウム細胞、近位尿細管細胞それぞれから、１２クローンのうち、上位６クローンを選択する。２３年度では、６つのクローンが得られ、現在Affimetrix社Human Genome U133A Plus2.0によりマイクロアレイ解析中である。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

東日本大震災の影響を東大でも受け、研究施設の一部の破損があり、研究開始が遅れた。しかし、その後は概ね順調に進んでおり、２４年度には遅れを取り戻せると考えている。

今後の研究の推進方策

Infinium解析で得られた遺伝子を特異的かつ強制的にOFFあるいはONとすることにより、腎臓由来iPS細胞から効率良く腎臓構成細胞を分化誘導する。さらに、分化誘導された細胞を既報のデバイスに播種し、SCIDマウスへ移植することにより、次世代人工腎臓として機能するか評価する。１、脱メチル化（活性化）すべき５遺伝子に関しては、iPS樹立時と同様にPlatE法を用い、レトロウイルスにより強制発現させる。メチル化が維持される（不活性化）５遺伝子については、siRNAを用いて遺伝子発現を抑制する。２、１の処置後、２－４週間培養し、腎臓系統のマーカー発現をreal time PCRで評価し、siRNAおよびレトロウイルスの条件を最適化する。３、２で最適化された条件で、更に２－８週間分化誘導を行い、組織染色により腎臓構成細胞への分化を検証する。４、３で得られた細胞をLanzaらの報告した以下のデバイスへ播種し、SCIDマウスへ移植する。移植後４－８週で、リザーバ内の尿産生、ユニット内の腎臓組織形成を検証する。

次年度の研究費の使用計画

siRNA関連試薬等一式、レトロウイルス関連試薬一式、組織染色試薬等一式、培養関連試薬等一式に加え、研究の進行を加速する為に、一部を人件費として使用する。

研究成果

• [雑誌論文] Eicosapentaenoic acid regulates IkBa and prevents tubulointestitial injury in kidney (2011)
  • 著者名/発表者名: Takase O, Hishikawa K, Kamiura M, Kawano H, Mizuguchi K, Fujita T
  • 雑誌名: Eur J Pharmacol 巻: 669 ページ: 128-135
  • 査読あり
• [学会発表] ヒト腎臓由来iPS細胞のDNAメチル化プロファイルと細胞記憶 (2011)
  • 著者名/発表者名: 菱川慶一、高瀬敦、出射真奈、藤田敏郎
  • 学会等名: 日本腎臓学会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2011年6月15日
• [図書] 再生医療叢書 (2011)
  • 著者名/発表者名: 菱川慶一
  • 総ページ数: 90
  • 出版者: 腎臓再生を目指した包括的戦略