| 研究課題/領域番号 |
23591276
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
川又 敏男 神戸大学, 保健学研究科, 教授 (70214690)
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| 研究分担者 |
小野 功貴 神戸大学, バイオシグナル研究センター, 教授 (10243297)
向井 秀幸 神戸大学, 医学研究科, 准教授 (80252758)
高橋 美樹子 帝京平成大学, 薬学部, 教授 (90324938)
前田 潔 神戸学院大学, 総合リハビリテーション学部, 教授 (80116251)
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| キーワード | 国際情報交換（カナダ） / 認知症 / 神経細胞変性 / 細胞内シグナル伝達 / タウ蛋白 / 蛋白リン酸化酵素 / 蛋白脱リン酸化酵素 |
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| 研究概要 |
一次性あるいは二次性タウ病として分類される変性型認知症患者の脳組織には、タウ蛋白が異常代謝を受け重合した細胞障害性オリゴマーが、また一部は細胞内封入体として沈着する神経原線維変化（タングル）が形成される。最も代表的な変性型認知症であるアルツハイマー型認知症（AD）では、認知症症状つまり神経回路障害の程度とタングル形成程度（数）との相関が報告されている。そこで、ADにおける神経細胞死メカニズムの解明および治療法開発に資するため、異常なタウ蛋白代謝の初期段階に生じる異常リン酸化についてリン酸化－脱リン酸化バランスの破綻や、その反応部位の制御異常の視点から、タウ代謝の上流を含めてリン酸化酵素・脱リン酸化酵素複合体に関わる細胞内シグナル伝達の異常を検討した。
それぞれ生理的にタウ蛋白を良好な基質とするPKN1、PKC、PKA、CK1 delta、Cdk2などの蛋白リン酸化酵素や、PP1、PP2A、PP2Bなど蛋白脱リン酸化酵素が種々の組合せで会合し、極性をもつ神経細胞の頂上区画・核周囲区画等さまざまな細胞内コンパートメントにその反応が厳密に制御されている巨大なscaffold分子を中心とする活性複合体とタウ蛋白との関連を、正常対照高齢者およびAD患者の脳組織を対象として解析した。とくにタウ代謝との関連が深いと考えられるPI3蛋白リン酸化酵素－PKB経路を介した細胞内情報伝達を分析して、同経路においてPDK1、PKC delta、p70 S6Kと異常タウ代謝との関連を明らかにし、またタングルと同様にAD脳において特徴的な神経細胞内封入体形成とS6Kとの関連を世界で初めて明らかにした。細胞内の活性複合体については、ケンドリンがセパラーゼの基質となり、中心体複製機構を介して細胞分裂に影響し、細胞周期制御に関与する可能性を国際誌に発表した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
正常対照高齢者や認知症とくにAD患者の死後剖検脳組織を対象として、タウ蛋白代謝に関連する複数の重要機能分子と活性複合体との共存・結合状態や神経細胞内会合部位を生化学的および形態学的に検討すると共に、プラットフォームとなる活性複合体に関係する機能分子について新たな知見を得ながら分析を進めている。細胞骨格の重要機能分子であるタウ蛋白のリン酸化修飾に直接関与する蛋白リン酸化酵素群（PKN1、PKC、PKA、CK1 delta、Cdk2等）および蛋白脱リン酸化酵素群（PP1、PP2A、PP2B等）と、細胞内でPKN1と相互作用することから発見された巨大プラットフォーム分子CG-NAPあるいはKendrinとが、種々の分子の細胞内会合状態の調節に関与し、さらにこのような会合が特定の細胞内コンパートメントで厳密に制御されており、タウ蛋白を含む重要基質分子のリン酸化状態を調節することで重要な細胞機能に関係していることを確認しつつある。
複雑なクロストークを示す蛋白リン酸化酵素の細胞内活性化カスケードのうち、PI3Kの下流にある細胞内情報伝達経路においてPI3K、PTEN、PDK1、PKC delta、p70 S6Kの変性神経細胞内局在を明らかにし、またこれら機能分子とタウ異常代謝との関連、あるいはS6Kについてアクチン細胞骨格病理との関連も発見した。さらに、KendrinについてはSeparaseの基質となり中心体複製の調節に関与することを世界で初めて明らかにした。細胞分裂、細胞周期の制御に関しても、さらに解析を進めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在までに得られた活性複合体に関する新たな知見の解析を継続すると共に、認知症関連遺伝子あるいはPKN1/PKN2遺伝子等に関する遺伝子改変動物の脳組織や培養細胞を対象として、タウ代謝に関連する重要機能分子の活性複合体に対する結合・共存状態や神経細胞内会合部位を、生化学的および形態学的に分析する。具体的には、まず前述の脳組織を対象としてCG-NAPおよびKendrinと活性複合体を構成するPKN1など複数の機能分子の組成や量、またそれらのリン酸化状態など活性状態を、また組織・細胞を分画後CG-NAP・Kendrinおよび共に活性複合体を構成する複数の機能分子の細胞内局在や会合・共局在部位を、免疫沈降・イムノブロット法等により生化学的に分析すると共に、高感度免疫組織化学法を用いた光学顕微鏡・共焦点レーザー顕微鏡・透過型電子顕微鏡観察により形態学的に検討する。その後、上記の遺伝子に関する遺伝子導入培養細胞を対象として、タウ代謝に関連する重要機能分子の活性複合体に対する結合・共存状態や神経細胞内会合部位を、免疫沈降・イムノブロット法等により生化学的に、また高感度免疫組織化学法を用いた光学顕微鏡・共焦点レーザー顕微鏡・透過型電子顕微鏡を用いた形態観察により、検討する。
PKN1遺伝子改変動物はreproductivityが低いため実験可能動物数が増えにくいが、この場合は解析可能な実験動物を使って研究を進める。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
上記のように健常高齢者あるいは認知症患者の脳組織を対象として、生化学的および形態学的分析を行い、その結果得られたタウ蛋白代謝に関連する重要機能分子とプラットフォーム分子が会合した活性複合体に関する知見を元にして、次年度は共同研究により現在利用可能な種々の認知症関連遺伝子の改変動物あるいは共同研究者が既に開発しているPKN1/PKN2遺伝子等に関する遺伝子改変動物の脳組織から得られた培養細胞あるいは遺伝子導入培養細胞を対象に生化学的・形態学的分析を実施する。具体的な計画内容は以下の通りである。
（1） 認知症関連遺伝子あるいはPKN1/PKN2遺伝子に関する遺伝子導入培養細胞を対象として、タウ代謝に関連する重要機能分子の活性複合体に対する結合・共存状態や神経細胞内会合部位を、免疫沈降・イムノブロット法等により生化学的に分析する。①CG-NAP、Kendrinと活性複合体を構成するPKN1など複数の機能分子の内容・量、またそれらのリン酸化状態など活性状態を解析する。②組織・細胞を分画後、CG-NAP・Kendrinおよび共に活性複合体を構成する複数の機能分子の細胞内局在を分析し、会合・共局在部位を検討する。
（2） 認知症関連遺伝子あるいはPKN1/PKN2遺伝子に関する遺伝子導入培養細胞を対象として、タウ代謝に関連する重要機能分子の活性複合体に対する結合・共存状態や神経細胞内会合部位を、高感度免疫組織化学法を用いた光学顕微鏡・共焦点レーザー顕微鏡・透過型電子顕微鏡観察により検討する。①CG-NAPあるいはKendrinと活性複合体を構成するPKN1など複数の機能分子の局在、またリン酸化特異抗体によりリン酸化状態など活性状態を解析する。②CG-NAP・Kendrinおよび共に活性複合体を構成する複数の機能分子の細胞内局在を分析し、タウ蛋白との会合・共局在部位を検討する。
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