| 研究課題/領域番号 |
23591343
|
|---|
| 研究機関 | 東北大学 |
|---|
研究代表者 |
井樋 慶一 東北大学, 情報科学研究科, 教授 (60232427)
|
|---|
| 研究分担者 |
布施 俊光 東北大学, 情報科学研究科, 助教 (50401039)
内田 克哉 東北大学, 情報科学研究科, 助教 (40344709)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2011-04-28 – 2014-03-31
|
| キーワード | CRF / ノルアドレナリン / プロラクチン放出ペプチド / 電気生理 / ラット / マウス |
|---|
| 研究概要 |
生体がストレスに応答する緊急時に、下垂体前葉のACTH分泌を促すCRFと後葉から分泌されるバゾプレシン(AVP)は、共に、延髄から視床下部に投射するノルアドレナリン（NA）作動性ニューロンによって刺激される。このNAニューロンにはプロラクチン放出ペプチド（PrRP）が共存しており、最近の我々の研究によれば、外因性のPrRPが、視床下部におけるNA作用を促進する（Uchida et al, 2010）。これらの事実を総合すれば「生体がストレスにさらされた時、PrRPがNAと共に分泌され、CRF-ACTHとAVPを介して生体防御に働く」という仮説が自然に導かれる。本研究では、in vivoとin vitroの手法を用いてこの仮説を検証することを目的とする。 視床下部CRFニューロンへのPrRPの作用メカニズムを明らかにするためには、直視下に電気生理学的実験を行うことが極めて有用であるが、未だCRFニューロンの蛍光可視化動物は作成されていない。そこで我々は、CRF-Creマウスを作成した。このマウスとGFPレポーターマウスとの交配によりCRFニューロンを選択的に蛍光標識できるマウスを得ることができる。既に、CRF-CreマウスとX-galレポーターマウスとの交配により、CRFニューロン選択的にベータガラクトシダーゼの発現が確認されており、Creリコンビナーゼ活性がCRFニューロン選択的に発現することが証明された。今後CRFニューロンの機能を明らかにするためにCRF-Creマウスは極めて強力な実験ツールと考えられる。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
PrRPやNAを含め、CRFニューロンへの神経性入力の機能的意義を明らかにするためには、電気生理やカルシウムイメージング法などの細胞生理学的手法が不可欠である。しかしながら、これまでCRFニューロンを選択的に蛍光可視化できる動物は作成されていなかった。我々は世界で初めて、CRF遺伝子ターゲティング法を用い、CRFニューロンにCreリコンビナーゼをノックインしたマウス（CRF-Creマウス）の作成に成功した。実績概要に記した通り、CreリコンビナーゼがCRFニューロン選択的に発現しfloxed mouseとの交配により組換えを行うことができることが実証された。 また、パッチクランプアンプを新規購入し（物品費）、これを用いて視床下部急性スライスを用いたノルアドレナリンの作用をホールセルクランプ法により検討中である。 したがって、次年度にPrRPのCRFニューロンへの直接作用を細胞生理学的に検討するための準備は万端である。東日本大震災で動物を用いたin vivoの実験は立ち合遅れたが、それを補って余りある成果を上げることができた。
|
| 今後の研究の推進方策 |
まず、in vitroの実験系によりPVNにおけるPrRPの作用メカニズムを明らかにする。単一ニューロンの観察を行うためにパッチクランプ法を用いた電気生理実験を行うが、平行して、カルシウムインジケーターFura2を用い、細胞内カルシウム濃度のリアルタイム測定を行う。個々の神経内分泌ニューロンへの作用メカニズムばかりでなく、多数のニューロン活動の同時観測によりPVN内局所回路においてPrRPおよびNAが果たす役割が明らかにされる。我々の開発したCRFニューロン選択的蛍光可視化マウスは極めて強力なツールとなるであろう。 次に、延髄のPrRP含有ニューロンが直接視床下部に投射すること、この神経路がストレスにより活性化され視床下部内でPrRPが分泌されることをin vivoの実験系で明らかにする。ストレスの種類によってPrRP分泌に及ぼす影響に違いが認められる可能性や、PrRPがCRFやAVP遺伝子発現に及ぼす分子メカニズムについても検討を行う。
|
| 次年度の研究費の使用計画 |
1. PVNおよびSONの大細胞におけるPrRPとNAの作用のin vitroでの検討 ラットまたはマウスを用い、視床下部急性スライスを作成する。NA添加によるEPSPの増加とfiringおよびEPSC（あるいはEPSC）の増加を確認し、同様にPrRPを添加して観察する。次に、NAとPrRPの相互作用を検討。動物購入、生理実験試薬、ガラス電極、などの物品費と動物飼育費が必要である。2. in vivoにおけるPrRPニューロン投射神経路の同定 ラットまたはマウスを用い、逆行性トレーサーにより延髄から視床下部へのPrRPニューロンの投射神経路を明らかにする。動物、試薬、ディスポーザブル器具などの物品および動物飼育費が必要である。3. 研究成果発表 得られた成果を国内外の学会で報告するための旅費が必要である。
|
