2012 年度実施状況報告書

全てのＨＬＡクラスＩを対象としたＣＭＶ特異的ＣＴＬ監視法および樹立法の開発

研究課題

研究課題/領域番号	23591418
研究機関	岡山大学
研究代表者	近藤英生岡山大学, 大学病院, 助教 (30379747)
キーワード	サイトメガロウイルス / CTL / 同種造血幹細胞移植
研究概要	1) 健常人CMV既感染者におけるCMVpp65抗原特異的CTLが拘束される免疫優位(Immunodominant)なHLAアリルの検索前年度、健常人血液検体および患者血液検体収集のためプロトコールをﾋﾄｹﾞﾉﾑ･遺伝子解析研究倫理審査委員会に申請し、承認を受けた。現在までに、5組のHLA一致血縁者間造血幹細胞移植患者、ドナーより同意を得て、移植前および移植後 day 30, day 60, day 90, day 180 の検体を保存した。CMVpp65由来エピトープが既知であるものをHLA-A:18種類、HLA-B:14種類、HLA-Cw:4種類のペプチドを合成し、準備しているが、HLA-A,B,Cの各アリルとも既知であったレシピエント・ドナーは1組のみであり、その他は、CMVpp65由来エピトープが未知であるアリル(HLA-A31:01,HLA-B13:01,B54:01,B55:02, HLA-C03:03,C*03:04)を含んでいたため、これらドナーでのCMVpp65特異的CTL株樹立およびエピトープ同定を行なっている。 2)造血幹細胞移植後患者におけるCMVpp65抗原特異的CTLのモニタリング当院における同種造血幹細胞移植後の患者末梢血中のCMVpp65特異的CTLの動態を解析する。既知および新規同定したCMVpp65抗原エピトープペプチドを用い、患者または幹細胞移植ドナーの有するそれぞれのHLAアリルに提示されるペプチドCD40－B細胞にパルスし、反応性をIFN-γ ELISPOT法にて解析する。CMVpp65由来エピトープがすべて既知であるレシピエント・ドナーについては、day180までの検体が揃い次第、未知であるアリルを有するレシピエント・ドナーについては、免疫優位なエピトープが確定し次第、IFNγELISPOT assay を行う予定である。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由現在5組のHLA一致血縁者間造血幹細胞移植患者、ドナーから検体保存を行なっているが、そのうち未知であるエピトープの同定作業がまだ済んでおらず、モニタリングを進めることができていない。
今後の研究の推進方策	下記計画に基づき、研究をすすめる予定である。造血幹細胞移植後患者におけるCMVpp65抗原特異的CTLのモニタリングにおいては、まず血縁者間造血幹細胞移植のドナー、レシピエントペア（双方ともCMV既感染者）において、CMVpp65抗原特異的CTLモニタリングを行い、その知見を基に、非血縁者間造血細胞移植患者に拡げていく予定としている。
次年度の研究費の使用計画	1)健常人CMV既感染者におけるCMVpp65抗原特異的CTLが拘束されるImmunodominantなHLAアリルの検索（平成24年度より継続） 2）新規CMVpp65抗原由来エピトープペプチドの同定 1)で樹立されたCTLのドナーが既に同定されたHLAアリル以外を有する場合は、新規エピトープの同定を試みる。樹立された抗原特異的CD8+T細胞をクローン化し、HLA拘束性、認識するエピトープを以前発表した方法（Kondo et al., Blood 2004）を用いて同定する。 3)　造血幹細胞移植後患者におけるCMVpp65抗原特異的CTLのモニタリング当院における同種造血幹細胞移植後の患者末梢血中のCMVpp65特異的CTLの動態を解析する。既知および新規同定したCMVpp65抗原エピトープペプチドを用い、患者または幹細胞移植ドナーの有するそれぞれのHLAアリルに提示されるペプチドまたはoverlapping　peptide　を末梢血単核球にパルスし、反応性をIFN-γ ELISPOT法にて解析する。前年度より続けている未知であるエピトープの同定作業が遅れているため、モニタリングの進行が予定より遅れており、今年度分も次年度行うこととなったため残額が生じている。