妊娠期に特有な後天性・血栓性微小血管障害症の分子病態とその制御機構解析

2012 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 23591425
• 研究機関: 奈良県立医科大学
• 研究代表者: 藤村 吉博 奈良県立医科大学, 医学部, 教授 (80118033)
• 研究分担者: 松本 雅則 奈良県立医科大学, 医学部, 准教授 (60316081) ; 佐道 俊幸 奈良県立医科大学, 医学部, 講師 (50275335) ; 早川 正樹 奈良県立医科大学, 医学部附属病院, 研究員 (30516729)
• キーワード: 妊娠関連TMA / HELLP症候群 / ADAMTS13 / 活性型VWF / 胎盤由来E-NTPase / 補体調節因子

研究概要

奈良医大輸血部で実施している本邦の血栓性微小血管障害症（TMA）患者のコホート研究を通じて2012年末までに後天性・妊娠関連TMAを20例同定した。この中には死後の剖検で診断された例もある(J Obstet Gynecol 2013)。
一方、本学倫理委員会承認下に、現在迄に本院で約200名の正常妊婦と6例のHELLP症候群例について連続的検体を集積し、von Willebrand 因子（VWF）と VWF特異的切断酵素であるADAMTS13活性を中心に解析した。その結果、「正常妊娠経過と共にADAMTS13活性は漸減し、VWF抗原量は著増する事から血小板血栓傾向にある」という成績を得た。しかし、これら正常妊娠経過中は顕著な血小板減少は観察されず、妊娠期特異的な血小板血栓調節機構の存在が改めて強く示唆された。また分娩直後のADAMTS13活性著減、またこの所見は分娩１ヶ月後には略正常化するという知見も得た。胎盤由来ADP 分解酵素（E-NTPase）はVWF依存性高ずり応力惹起血小板凝集を濃度依存性に阻害することから、このマイクロパーテイクルは正常妊娠経過中の血栓調節機構を担う物質と考えられる。これより胎盤からE-NTPaseを精製し、新旧合わせて計15種類のマウスモノクローナル抗体を作成した。これら抗体を用いて、血漿中の微量E-NTPaseの測定系を現在構築中である。
次に、HELLP症候群では血中に「活性型 VWF」が出現するとの説があるが、そのEBMは示されていない。一方、重糖化蛋白質VWFからneuraminidaseを用いて脱シアル化した asialo-VWFはアゴニスト無く血小板に結合し、これを凝集させる人為的活性型VWFである。これよりasialo-VWFに対するモノクローナル抗体をHELLP症候群の病態解明に使用する事を考えており、この抗体を現在作成中である。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

約200名の正常妊婦から採取された経時的な血液検体を用い、ADAMTS13とVWF解析を通じて、これら2項目の動向を観察し得た。一方、妊婦血中に ADP分解活性の存在を確認しているが、測定に用いるマラカイトグリーン法は試料中の遊離リンを定量するため、特異的E-NTPase活性を検出するのに苦慮している。また、血中に遊離型として存在すると考えられるE-NTPase酵素蛋白は極微量と考えられるために、通常のELISAやwestern blotでの検出が困難である。これより、同酵素蛋白に対する高親和性モノクローナル抗体を作成し、これらを用いた flow cytometryや captured ELISAでの定量法を計画である。尚、前記のasialo-VWFに対するモノクロナール抗体は現在作成中である。

今後の研究の推進方策

引き続き妊婦検体の収集を行い、順次ADAMTS13活性とVWF抗原量測定を実施するが、 今年度は特にE-NTPase抗原量・活性測定に焦点をあて解析を行う。E-NTPaseの抗原・活性測定方法については現在、構築段階であるELISA系を用いて行う予定であるが、血漿中のE-NTPaseは極微量であると考えられるため、ELISA系での測定が困難な場合には、フローサイトメーターによる測定系を考慮する。申請者らは、E-NTPaseは血管内皮細胞由来のマイクロパーティクル（EDMP）様の物質として血漿中に放出されると考えており、EDMPについては抗CD144抗体を用いた測定法が既に確立されている。そこで、申請者らが作成したE-NTPaseに対するモノクローナル抗体を蛍光標識し、これと抗CD144抗体の両者を用いることで、血漿中のE-NTPase測定系の確立を行う。
さらに申請者らは、最近「非典型HUS(aHUS)の原因となる補体や補体調節因子であるcomplement factor H（CFH）等の蛋白-遺伝子解析アルゴリズムを完成した (Molecular Immunology 2013)。aHUS発作は妊娠によっても惹起されると考えられているので、これらの解析系の構築は今後の妊娠関連TMAの病態解析について更なる展開が期待出来ると考えている。また本研究の成果については、本年度に学会発表を行う予定である。

次年度の研究費の使用計画

該当なし。

研究成果

• [雑誌論文] Ratio of von Willebrand factor propeptide to ADAMTS13 is associated with severity of sepsis. (2013)
  • 著者名/発表者名: Fukushima H, Nishio K, Asai H, Watanabe T, Seki T, Matsui H, Sugimoto M, Matsumoto M, Fujimura Y, Okuchi K.
  • 雑誌名: Shock. 巻: 39 ページ: 409-414
  • DOI: 10.1097/SHK.0b013e3182908ea7.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Autopsy case of sudden maternal death from thrombotic thrombocytopenic purpura. (2013)
  • 著者名/発表者名: Yamamoto T, Fujimura Y, Emoto Y, Kuriu Y, Iino M, Matoba R.
  • 雑誌名: J obset Gynaecol Res. 巻: 39 ページ: 351-354
  • DOI: 10.1111/j.1447-0756.2012.01941.x.
  • 査読あり
• [雑誌論文] A novel Wiskott-Aldrich syndrome protein mutation in an infant with thrombotic thrombocytopenic purpura. (2013)
  • 著者名/発表者名: Kawasaki Y, Toyoda H, Otsuki S, Iwasa T, Iwamoto S, Azuma E, Itoh-Habe N, Wada H, Fujimura Y, Morio T, Imai K, Mitsuiki N, Ohara O, Komada Y.
  • 雑誌名: Eur J Haematol. 巻: 90 ページ: 164-168
  • DOI: 10.1111/ejh.12057.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Analysis of genetic and predisposing factors in Japanese patients with atypical hemolytic uremic syndrome. (2013)
  • 著者名/発表者名: Fan X, Yoshida Y, Honda S, et al. (Fujimura Y, last author)
  • 雑誌名: Mol Immunol. 巻: 54 ページ: 238-246
  • DOI: 10.1016/j.molimm.2012.12.006.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Drug-induced Thrombotic Thrombocytopenic Purpura Successfully Treated with Recombinant Human Soluble Thrombomodulin. (2013)
  • 著者名/発表者名: Nishijima Y, Hirata H, Himeno A, Kida H, Matsumoto M, Takahashi R, Otani Y, Inoue K, Nagatomo I, Takeda Y, Kijima T, Tachibana I, Fujimura Y, Kumanogoh A.
  • 雑誌名: Intern Med. 巻: 52 ページ: 1111-1114
  • 査読あり
• [雑誌論文] Ticlopidine-associated ADAMTS13 activity deficient thrombotic thrombocytopenic purpura in 22 persons in Japan: a report from the Southern Network on Adverse Reactions (SONAR). (2013)
  • 著者名/発表者名: Bennett CL, Jacob S, Dunn BL, et al. (Fujimura Y, last author)
  • 雑誌名: Br J Haematol. 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • 査読あり
• [雑誌論文] The first bout of TTP triggered by herpes simplex infection in a 45-year-old nonparous female with Upshaw-Schulman syndrome (2013)
  • 著者名/発表者名: Morioka M, Matsumoto M, Saito M, Kokame K, Miyata T, Fujimura Y.
  • 雑誌名: Blood Transfusion. 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • 査読あり
• [雑誌論文] ADAMTS13 activity and genetic mutations in Japanese subjects (2013)
  • 著者名/発表者名: Miyata T, Kokame K, Matsumoto M, Fujimura Y.
  • 雑誌名: Hamostaseologie 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
• [雑誌論文] Therapeutic modality of 11 patients with TTP: Experience in a single institution in Miyazaki during 2000-2011 (2013)
  • 著者名/発表者名: Kawano N, Yokota-Ikeda N, Sugio Y, Yoshida S, Ono N, Kuriyama T, Yamashita K, Makino S, Inoue Y, Himeji D, Kodama K, Uezono S, Shimao Y, Matsumoto M, Iino H, Fujimura Y
  • 雑誌名: Intern Med. 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • 査読あり
• [雑誌論文] ADAMTS13 unbound to larger von Willebrand factor multimers in cryosupernatant: Implications for selection of plasma preparations for TTP treatment (2013)
  • 著者名/発表者名: Hori Y, Hayakawa M, Isonishi A, Soejima K, Matsumoto M, Fujimura Y
  • 雑誌名: Transfusion 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • 査読あり
• [雑誌論文] Limited renal prophylaxis in regular plasmatherapy for heritable ADAMTS13 deficiency (2013)
  • 著者名/発表者名: Doi T, Ohga S, Ito N, Ishimura M, Suga N, Nomura A, Takada H, Matsumoto M, Fujimura Y, Hara T
  • 雑誌名: Pediatric Blood & Cancer 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • 査読あり
• [雑誌論文] Hereditary thrombotic thrombocytopenic purpura (Upshaw-Schulman syndrome) and the hereditary TTP registry (2013)
  • 著者名/発表者名: Mansouri M-T,von Krogh A-S, Fujimura Y, George JN, Hrachovinova I, Knӧbl PN, Quist-Paulsen P, Schneppenheim R, Lӓmmle B, Kremer-Hovinga JA
  • 雑誌名: Hamostaseologie 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • 査読あり
• [雑誌論文] Pediatric idiopathic TTP diagnosed with decreased ADAMTS13 activity. (2012)
  • 著者名/発表者名: Morishima T, Nomura A, Saida S, Watanabe K, Yagi H, Matsumoto M, Fujimura Y, Heike T, Nakahata T, Adachi S.
  • 雑誌名: Pediatr Int. 巻: 54 ページ: 422-423
  • DOI: 10.1111/j.1442-200X.2011.03467.x.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Identification and recombinant analysis of botrocetin-2, a snake venom cofactor for von Willebrand factor-induced platelet agglutination. (2012)
  • 著者名/発表者名: Yamamoto-Suzuki Y, Sakurai Y, Fujimura Y, Matsumoto M, Hamako J, Kokubo T, Kitagawa H, Kawsar SM, Fujii Y, Ozeki Y, Matsushita F, Matsui T.
  • 雑誌名: Biochemistry. 巻: 51 ページ: 5329-5338
  • 査読あり
• [雑誌論文] Identification of epitopes on ADAMTS13 recognized by a panel of monoclonal antibodies with functional or non-functional effects on catalytic activity. (2012)
  • 著者名/発表者名: Igari A, Nakagawa T, Moriki T, Yamaguchi Y, Matsumoto M, Fujimura Y, Soejima K, Murata M.
  • 雑誌名: Thromb Res. 巻: 130 ページ: e79-83
  • DOI: 10.1016/j.thromres.2012.06.006.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Cilostazol down-regulates the height of mural platelet thrombi formed under a high-shear rate flow in the absence of ADAMTS13 activity. (2012)
  • 著者名/発表者名: Yagi H, Yamaguchi N, Shida Y, Hayakawa M, Matsumoto M, Sugimoto M, Wada H, Tsubaki K, Fujimura Y.
  • 雑誌名: Eur J Pharmacol. 巻: 691 ページ: 151-155
  • DOI: 10.1016/j.ejphar.2012.07.001.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Paucity of CD34-positive cells and increased expression of high-mobility group box 1 in coronary thrombus with type 2 diabetes mellitus. (2012)
  • 著者名/発表者名: Yamashita A, Nishihira K, Matsuura Y, Ito T, Kawahara K, Hatakeyama K, Hashiguchi T, Maruyama I, Yagi H, Matsumoto M, Fujimura Y, Kitamura K, Shibata Y, Asada Y.
  • 雑誌名: Atherosclerosis. 巻: 224 ページ: 511-514
  • DOI: 10.1016/j.atherosclerosis.2012.07.027.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Ticlopidine-, clopidogrel-, and prasugrel-associated thrombotic thrombocytopenic purpura: a 20-year review from the Southern Network on Adverse Reactions (SONAR). (2012)
  • 著者名/発表者名: Jacob S, Dunn BL, Qureshi ZP, et al. （Fujimura Y 21番目）
  • 雑誌名: Semin Thromb Hemost. 巻: 38 ページ: 845-853
  • DOI: 10.1055/s-0032-1328894.
• [雑誌論文] Two newborn-onset patients of Upshaw-Schulman syndrome with distinct subsequent clinical courses (2012)
  • 著者名/発表者名: Tanabe S, Yagi H, Kimura T, Isonishi A, Kato S, Yoshida Y, Hayakawa M, Matsumoto M, Ohtaki S, Takahashi Y, Fujimura Y.
  • 雑誌名: Int J Hematol. 巻: 96 ページ: 789-797
  • DOI: 10.1007/s12185-012-1221-8.
  • 査読あり
• [学会発表] 均一な集団と考えられるADAMTS13 活性著減（＜0.5%）後天性特発性TTP 150 例の解析.
  • 著者名/発表者名: 松本雅則，Bennett Charles，石西綾美，Qureshi Zenia，堀勇二，早川正樹，吉田瑶子，八木秀男，藤村吉博.
  • 学会等名: 第34回日本血栓止血学会学術集会.
  • 発表場所: ハイアットリージェンシー（東京）
• [学会発表] TMA：診断と治療の新しい展開
  • 著者名/発表者名: 藤村吉博
  • 学会等名: 第21回 群馬血液疾患研究会
  • 発表場所: 群馬ロイヤルホテル（群馬）
  • 招待講演
• [学会発表] ADAMTS13-VWFの均衡破綻による血栓性微小血管障害症
  • 著者名/発表者名: 藤村吉博
  • 学会等名: 第３回 Global and New Insight into HSCT研究会
  • 発表場所: ウエスティン都ホテル京都（京都）
  • 招待講演
• [学会発表] 本邦でのaHUS患者のdiagnostic pathwayと登録状況
  • 著者名/発表者名: 藤村吉博
  • 学会等名: 第49回補体シンポジウム
  • 発表場所: 大阪府立成人病センター（大阪）
  • 招待講演
• [学会発表] TMA:診断と治療の新しい展開
  • 著者名/発表者名: 藤村吉博
  • 学会等名: 第19回岐阜血液研究会
  • 発表場所: 岐阜グランドホテル（岐阜）
  • 招待講演
• [学会発表] Establishing a TTP diagnostic network in Japan -Experience at Nara-
  • 著者名/発表者名: Yoshihiro Fujimura
  • 学会等名: International and ANZ Steering Committee for APMAT Research Network
  • 発表場所: Melbourne Convention Center（オーストラリア）
  • 招待講演
• [学会発表] 本邦におけるTMA解析状況
  • 著者名/発表者名: 藤村吉博
  • 学会等名: 第７回日本血栓止血学会学術標準化委員会シンポジウム
  • 発表場所: 東医健保会館（東京）
  • 招待講演
• [学会発表] TMA病態に対する新鮮凍結血漿由来ADAMTS13の治療効果
  • 著者名/発表者名: 藤村吉博
  • 学会等名: 石川県合同輸血療法委員会
  • 発表場所: 石川県地場産業振興センター（石川）
  • 招待講演
• [学会発表] Unusually large VWF multimers appearing in patient plasmas of HSCT predispose TMA:Management with plasma ADAMTS13 and recombinant soluble thrombomodulin
  • 著者名/発表者名: Hayakawa M, Matsumoto M, Fujimura Y
  • 学会等名: Jahrestagung der Gesellschaft fur Thrombose- und Hamostaseforschung (GTH)
  • 発表場所: ICM-Internationales Congress Center Munchen（ドイツ）
• [学会発表] ADAMTS13: Biology and Upshaw-Schulman Syndrome
  • 著者名/発表者名: Yoshihiro Fujimura
  • 学会等名: 23rd Annual Hemophilia Research Study Update Meeting(HRSU)
  • 発表場所: THE GRAND HOTEL MALAHIDE（アイルランド）
  • 招待講演
• [図書] Annual Review 血液 (2013)
  • 著者名/発表者名: 松本雅則、藤村吉博
  • 総ページ数: 8
  • 出版者: 中外医学社
• [図書] 新版日本輸血・細胞治療学会認定医制度指定カリキュラム (2012)
  • 著者名/発表者名: 藤村吉博
  • 総ページ数: 3
  • 出版者: 日本輸血・細胞治療学会
• [備考] 難病情報センター「血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）」
  • URL: http://www.nanbyou.or.jp/entry/87