研究課題
β2-グリコプロテインI（β2GPI）は5つのドメインからなる糖タンパクで、二次性血栓症・習慣流産の原因として重要である抗リン脂質抗体症候群における自己抗原として知られている。最近我々は、β2GPIがプラスミンによって限定分解を受けた産物であるニックβ2GPIが、おそらくそのドメインVを介して同じくプラスミンの自己分解産物で強力な血管新生抑制物質であるアンジオスタチンに結合、その作用を阻害する事を報告した (Nakagawa et al., Blood 2009)。この研究により、血栓部位ではニックβ2GPIが血管新生に働く可能性が示唆された。一方で, β2GPI自体にはそのドメインIを介したVEGF依存性の血管新生抑制作用が報告されており、ニックβ2GPIの血管新生における作用を複雑なものにしている。本研究ではニックβ2GPIドメインVをリコンビナント蛋白として作製し、血栓部位における血管新生効果が得られるかどうかを検討することを目的とした。該当年度には、リコンビナントβ2GPIドメインVをコードする発現ベクターをほ乳類用・大腸菌用とも作製し、ほ乳類細胞および大腸菌を用いて発現、Tagを用いて精製した。リコンビナントβ2GPIドメインVの一部はプラスミン処理にてニックβ2GPIドメインVとした。尚、コントロールとしてβ2GPIドメインIを作製した。作製した インタクト・ニックβ2GPIドメインVを用いて、まずは BIACOREを用いた分子間相互作用解析によりアンジオスタチンとの結合試験を行った。アンジオスタチンをビオチン化してチップに固定化、インタクトまたはニックβ2GPIドメインVをアナライトとして解析を行った。結果、インタクトβ2GPIドメインVはアンジオスタチンに結合しなかったのに対し、ニックβ2GPIドメインVはアンジオスタチンに対して用量依存性の結合を示した。
3: やや遅れている
当初作製していたβ2GPIドメインVの発現ベクターはほ乳類細胞用のもので、FLAG tagを付加していたため精製は容易であったが、充分量を効率よく得ることができず、大腸菌の系に変換する必要があったため、若干の遅れが生じている。
ヒト大動脈血管内皮細胞 (HAEC) を用いて細胞増殖アッセイ を行う。アンジオスタチン単独の添加ではHAECの増殖抑制に働くことが分かっているが、ここにニックβ2GPIドメインVを添加することによって細胞増殖抑制作用を阻害し結果的にHAECが増殖するかどうかを検討する。このとき、大前提としてニックβ2GPIドメインV が単独ではHAECの増殖を阻害しないことも確認しておく。続いて血管内皮細胞の遊走への影響を評価する目的でMatrigel Invasion chamber (BD Biosciences) を用い、ヒト臍帯血管内皮細胞 (HUVEC) の遊走実験を行う。マトリゲルを通過したHUVECを染色・カウントし、アンジオスタチン存在下にニックβ2GPIドメインVを添加することでアンジオスタチンによる内皮細胞遊走抑制効果が阻害されるかどうか確認する。β2GPI はそのドメインIを介してVEGF依存性の血管新生を阻害することが知られている(Yu et al., J thromb Haemost. 2008)。ここでは、HUVECと線維芽細胞をVEGF, FGF存在下に共培養するin vitro tube formation Assay (Kurabo) を用いて、まずはニックβ2GPIドメインVが単独ではVEGF存在下に血管新生を抑制しないことを確認する。そのうえで、ニックβ2GPIドメインVがアンジオスタチンの管腔形成抑制効果を阻害し、結果的に血管形成を促進するかについて検討する。
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Arthritis Rheum
巻: 64 ページ: 5004-5012
10.1002/art.33340
Arthritis Res Ther
巻: 13 ページ: R154
doi:10.1186/ar3470
J Rheumatol
巻: 38 ページ: 2209-2214
10.3899/jrheum.110289
Lupus
巻: 20 ページ: 1047-1056
10.1177/0961203311403347
Mod Rheumatol
巻: 21 ページ: 276-281
10.1007/s10165-010-0386-3
巻: 21 ページ: 444-448
10.1007/s10165-011-0421-z
