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今回の研究において、遺伝子変異を有するIV型コラーゲンα5鎖(α5(IV)鎖)を発現するトランスジェニックマウスを作成、そのオスをC0L4A5ノックアウトマウス(ヘテロのメス)と交配することにより、変異α5(IV)鎖のみを発現するモデルマウス(オス)を作出することを計画した。先ず、Gly524AspないしGly1196Arg変異を有するα5(IV)鎖を発現するトランスジェニックマウスを作成するためのプラスミドを構築した。マウスC0L4A5遺伝子cDNAにそれぞれの変異を導入し、全コード領域をトランスジェニックマウス作成において頻用されるpCAGGS哺乳動物細胞発現ベクターにサブクローニングした。改変部の塩基配列を確認した後、高純度プラスミドの精製を行った。また、これら2種類のプラスミドをHEK293細胞にトランスフェクションし、その全細胞抽出液に対し抗α5(IV)鎖抗体を用いたウエスダンブロッティング解析を行うことにより、これらのプラスミドが哺乳動物細胞中で発現することを確認した。さらに、マウスC0L4A5cDNA特異PCRプライマーを作成し、前述のα5(IV)鎖導入HEK293細胞から抽出したゲノムDNAにおいてPCRを行い、これらのプライマーがトランスジェニックマウスにおけるジェノタイピングに使用できることを確かめた。以上により、構築した2種類の発現プラスミドがトランスジェニックマウスの作成に有用であると考えられた。
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