| 研究課題/領域番号 |
23592032
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| 研究機関 | 山梨大学 |
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研究代表者 |
榊原 賢士 山梨大学, 医学部附属病院, 助教 (40419338)
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| 研究分担者 |
松本 雅彦 山梨大学, 医学工学総合研究部, 教授 (30372501)
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| キーワード | 内膜肥厚 / 動脈硬化 |
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| 研究概要 |
最近silorimus（rapamycin）が薬物溶出性ステントに使用されており、冠動脈へステント留置後、再狭窄抑制作用が有効であることが示されている。rapamycinはmTOR（mammalian Target Of Rapamycin）を抑制し細胞増殖、遊走の抑制、アポトーシスを促進し冠動脈内の内膜肥厚を抑制する。このことにより冠動脈ステントの開存率が改善されてきた。しかし、下肢のバイパスや冠動脈バイパス手術においてグラフト閉塞の原因となる内膜肥厚に対し、抗凝固剤投与等行われてきたが効果が少なく、現在まで内膜肥厚の抑制法は確立されていない。今回、われわれは、silorimus（rapamycin）のターゲットであるmTORに注目し、グラフト吻合部でこの活性を抑制することにより内膜肥厚を抑えることを目標とした。われわれは以前よりsiRNA mTORのtransfectionの条件を検討し実際にその条件で大伏在静脈の平滑筋細胞に導入すると、観察細胞数が著しく低下することを確認している。ラパマイシンによりmTORの活性を抑制することにより細胞のアポトーシスを誘導することからsiRNAによりｍTORの活性化が抑制され培養細胞が減少したと考えている。前年度はバイパス吻合部となる動脈への効果を検討した。さらに、今回,mTORを抑制した状態を確認するために、mTORより一つ下流に当たるp70 S6kinaseにおいても検討することとし、p70 S6kinaseの発現については、ELISAキットを使用して蛋白発現、リン酸化の評価する方針とした。また、糖尿病、高脂血症、透析などの動脈硬化性病変の強い大伏在静脈でどの因子がmTOR, S6kinaseが活性化しているかＤＮＡマイクロアレイで評価する準備を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
昨年に続き、正常ヒト大動脈平滑筋細胞、大伏在静脈平滑筋細胞にコントロールsiRNA (GFP)をtransfectionし効率のよい条件を検討しつつ、siRNA transfectionを行っているが安定ししたデーターをとることに難渋している。研究が遅れている状況なので、mTORだけでなく合わせてその下流であるp70 S6kinaseなどにも広げる方針としている。
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| 今後の研究の推進方策 |
基本的には昨年度から研究目標は大きな変更なく継続する予定である。
１．ヒト正常大動脈壁の平滑筋細胞へsiRNA mTORのtransfectionの確立と評価。平滑筋細胞を培養し、アテロコラーゲン法を用いてコントロールsiRNAを導入する。導入効率良い条件で、siRNA mTORを使用し、導入した細胞のmTORのタンパク質、RNAの生成の抑制を評価する。免疫染色でのmTORのタンパクの発現量も検討する予定である。次に、siRNA mTORを導入した細胞とコントロールの細胞の生理学的評価を行う。
細胞遊走－modified boyden chamberを使用し膜を貫通し遊走した細胞を計測する予定。細胞増殖-コントロール群とsiRNA mTOR群での増殖の差を培養１日目、３日目、７日目で計測する。アポトーシス－Cell Death detection ELISA(Roche)。
上記の実験結果がこの研究の基本となるため、安定した確実な結果が必要であるため繰り返しの実験が必要である。
２．今後は、糖尿病、高脂血症、透析などの動脈硬化を起こす因子のうち大伏在静脈でどの因子がmTOR, S6kinaseが活性化しているかヒト検体を用いてＤＮＡマイクロアレイで評価する準備も進めている。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
今後、研究費使用計画として昨年と同様に細胞培養関連（シャーレ、培養液、ウシ胎児血清）、siRNA mTOR(cell signaling社)各種試薬(ＰＤＧＦなど)、ヒト大動脈正常細胞（平滑筋細胞）などの消耗品の購入。上記実験と並行してマウスでの実験の準備品の購入を考えている。現在、この研究と平行しCREBの発現実験、肺癌のmTORの実験と共有可能であったため残額が生じた。
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