研究課題
ヒトグリオーマの予後に関連する19q13ゲノム領域に存在するPICT1遺伝子を解析したところ、PICT1はリボソームタンパク質L11を核小体へ留めることで核小体ストレス応答を制御すること、PICT1遺伝子を欠損させると核小体ストレス応答を起こし、p53の増加による細胞増殖抑制を起こすことをES細胞や欠損マウスを用いて明らかにしてきた。本研究ではPICT1のヒトグリオーマにおける役割を明らかにし、治療薬開発へつなげることを目的とする。まず、shRNAをグリオーマ細胞へ導入し、PICT1の発現を抑制した。PICT1を抑制した細胞は、p53の安定化を認め、著しく細胞増殖が抑制された。この効果は、野生型p53を発現する細胞ではみられるが、変異p53を発現する細胞ではみられないことから、PICT1による細胞増殖制御はp53に依存性であった。次に、PICT1遺伝子欠損マウスを作製し、個体レベルでPICT1の発がんにおける機能を解析した。PICT1遺伝子をヘテロ欠損するマウスは野生型マウスに比べDMBA、TPAによる皮膚化学発癌が著しく抑制されることを見出した。このようにPICT1を発現抑制することで、腫瘍化進展を抑制できると考えられ、PICT1の発現や機能を抑制する薬剤は抗がん剤となると予想された。PICT1はRPL11との結合によってp53の発現を制御することから、次にPICT1-RPL11分子間結合を検出できるシステムの構築を行うこととした。すなわち、PICT1とRPL11を組み換え蛋白質として調整し、AlphaScreen法によってPICT1-RPL11タンパク質の分子間結合を測定できる検出法の構築を進めている。今後、AlphaScreen法によってPICT1とRPL11との結合を阻害できる薬剤を探索し、新規作用機序を持つ抗がん治療薬を開発する。
2: おおむね順調に進展している
これまで不明であったグリオーマでのPICT1の役割が解明でき、PICT1を標的とした治療薬スクリーニング系の構築も進めていることから、今後PICT1を標的とした新規な作用をもつ抗がん治療薬の開発が期待できる。このように、本研究は概ね順調に進展している。
AlphaScreen法を用いたPICT1とRPL11とのタンパク質分子間結合を検出できる系の構築を完了させる。まず、大腸菌内でPICT1及びRPL11組換えタンパク質を発現精製する。次に、AlphaScreen法を用いて、これら蛋白質の結合を検出できる条件を決定する。特に、AlphaScreen法の検出に当たっては、非標識タンパク質を過剰に添加することで、標識タンパク質との結合競合阻害が起こるか等を検討し、定量的に分子間結合を検出できるかを確認する。結合量を定量できるシステムを作製したのちは、標準化合物を用いて小規模なスクリーニングを行う。ここで化合物が得られたならば、大規模な化合物ライブラリーを用いてスクリーニングを実施し、より効果のあるシード化合物を選択する。シード化合物は、p53が保たれたがん細胞へ添加し、抗腫瘍効果の有無を明らかにする。
平成24,25年度に、PICT1とRPL11との結合領域の決定とグリオーマの新規治療薬の開発を行うことを予定していたが、この測定のために必要なPICT1タンパク質を小麦胚芽抽出液を用いたin vitro translation法によって合成を試みたが十分な量が得られず、測定を完了させることができなかったため、未使用額が生じた。今年度、PICT1タンパク質を大腸菌の組換えタンパク質として発現精製し、これを材料としてPICT1-RPL11との結合領域の決定と結合阻害化合物のスクリーニングを行うように計画を変更し、未使用額はその経費に充てることとする。
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http://www.kufm.kagoshima-u.ac.jp/~moloncl2/
