| 研究課題/領域番号 |
23592214
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| 研究機関 | 奈良先端科学技術大学院大学 |
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研究代表者 |
北川 教弘 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助教 (30294284)
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| キーワード | 骨・軟骨代謝学 / 破骨細胞 / 骨吸収 / NFATc1 / ITAM |
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| 研究概要 |
本申請では破骨細胞における新規DAP12会合受容体Siglec-15の骨代謝における意義、またその作用機序をin vivoおよびin vitroで明らかにすることを目標とする。
Siglec-15には酵素活性領域を有していないことから、その機能には他タンパク質との会合が重要であると考えられる。実際に破骨細胞抽出液をNative-PAGEにより分離し抗Siglec-15抗体でウェスタンブロットした結果から、Siglec-15は約250kDaの複合体を形成していることが示唆された。そこでHis6タグおよびFLAGタグをタンデムにC末端に付加したSiglec-15を破骨細胞に強制発現させ、その細胞抽出液からNi-NTAレジンならびに抗FLAG抗体ビーズを用いたアフィニティー精製によりSiglec-15複合体を精製した。精製したタンパク質群を質量分析法により解析した結果、DAP12とともに新規Siglec-15会合タンパク質SBP1 (仮称)の同定に成功した。Siglec-15とSBP1の会合様式について検討した結果、SBP1との会合に必要なアミノ酸配列がSiglec-15の細胞質内領域にあることを見出した。さらに本配列を欠失したSiglec-15変異体はSiglec-15遺伝子欠損マウス由来破骨細胞の表現型を回復し得ないことからSiglec-15の機能にはSBP1との会合が必要であることが強く示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度はSiglec-15遺伝子欠損マウスの骨代謝ならびに骨組織の解析は未だなしえていない。これはノックアウトマウス作成時に129系由来ES細胞を用いたため、得られる遺伝子改変マウスの遺伝的背景が通常解析に用いられるC57BL/6とは異なるため戻し交配を行う必要があるためであり、想定内である。また平成２４年度中にほぼ十分な戻し交配を完了しており、本解析は平成２５年度中に行い得る。
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| 今後の研究の推進方策 |
1. Siglec-15の細胞外領域、内在性DAP12との会合し得ないK272A変異を持つ膜貫通領域、およびSBP1会合領域と、DAP12細胞質内領域を融合させたキメラタンパク質発現ベクターを構築する。本ベクターをまずSiglec-15遺伝子欠損マウスから調製した破骨前駆細胞に遺伝子導入し、Siglec-15の機能を代償し得るかをin vitro実験系において検討する。本キメラタンパク質がシアル酸認識能に必須なV-setドメインおよびITAM依存的にSiglec-15の機能を代償することが示された場合、破骨細胞特異的プロモーター（catepsinK遺伝子やTRAP遺伝子）制御下で発現するトランスジェニックマウスを樹立する。
2. Siglec-15遺伝子欠損マウスの樹立を行い、骨形態計測や骨代謝マーカーの測定を行うことで、Siglec-15遺伝子の生理的条件下における意義を検討する。本マウスが骨吸収低下に伴う骨量増加を示した場合、1.で作成した。Siglec-15/DAP12キメラトランスジェニックマウスをSiglec-15遺伝子欠損マウスと交配し、これらマウスの骨代謝や骨組織を検討することにより、Siglec-15が破骨細胞における重要なDAP12会合受容体として機能するのかについて検討する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
平成24年度に未使用額が生じた要因は、研究の進捗状況に合わせ予算執行計画を変更したことに伴うものである。特にSiglec-15遺伝子欠損マウスの骨形態計測ならびに骨代謝の評価するためには当マウスの遺伝的背景をC57BL/6に純化する必要があり、本解析を次年度に繰り越したことが大きな要因の一つである。
次年度の請求額と合わせての執行計画は以下のとおりである。Siglec-15遺伝子欠損マウスの骨組織および骨代謝の解析のために骨形態計測委託費や骨代謝マーカー測定キットなどの消耗品の購入、本マウス系統維持のための拝凍結サービスに使用する。細胞培養や生化学・分子生物学的手法における消耗品や試薬・酵素類を購入する。また研究成果発表のための雑誌投稿料ならびに学会参加費とその旅費に予算を執行する。
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