| 研究課題/領域番号 |
23592253
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
澁田 達史 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (20324767)
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| 研究分担者 |
上林 卓彦 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (10273640)
宮本 善一 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (70278844)
小阪 淳 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 准教授 (40243216)
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| キーワード | 培養神経細胞 / ケタミン / グルタミン酸 |
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| 研究概要 |
今回の我々の研究では、ウイスターラット妊娠16日目の胎児から大脳皮質神経細胞ならびに海馬神経細胞を分離した初代培養神経細胞に対して高濃度のグルタミン酸を付加し、人工的に脳虚血状態モデルを作成した。培養神経細胞に対し、静脈麻酔薬ケタミン、チオペンタールナトリウム並びにプロポフォールを付加した場合において、形態学的に生存と判定された脳神経細胞に対してカルシウムイメージングを行い、細胞の分子生物学的特徴を明らかにすることを目標とした。
目標通り、平成25年度においては、ラット16日目の胎児から大脳皮質神経細胞ならびに海馬神経細胞を分離し、硝子ボトムディッシュ（松浪硝子D111505）上に初代培養を安定的に培養神経細胞が作成している。この細胞を利用し、14日間の培養後、Ca2+感受性インディケーター及び共重合型界面型活性剤プルロニックF-127を暴露し、油浸対物レンズFlour (Carl-Zeiss)を装着した倒立顕微鏡Axiovert 200 (Carl-Zeiss) 、CCDカメラ(Orca FR, 浜松フォトニクス)、画像イメージ処理用のAquacosmos (浜松フォトニクス)の設備を利用し、蛍光励起(fluorescence excitation)のための150Wのキセノンランプを暴露することにより、GABAやグルタミン酸などの神経刺激物質を加えた際の蛍光強度の上昇を細胞内カルシウム濃度の変化として測定し、データを収集、解析を加えている。現在、きわめて順調にデータが収集され、解析を加えている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
初代培養神経細胞をカルシウムイメージングのため、硝子ボトムディッシュ上で安定的に生育することが考となった。また、静脈麻酔薬ケタミン、チオペンタールナトリウム、プロポフォールをあらかじめ投与し、人工脳虚血状態に暴露した上で、生存脳神経細胞に対素、グルタミン酸を付加し細胞内カルシウム濃度を測定することに成功した。
以上の事より極めて順調に進行していると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、現在までにデータを収集した静脈麻酔薬ケタミン、チオペンタールナトリウム、プロポフォール療法を実施した場合の、人工脳虚血状態に対し、神経保護作用がしめされた初代培養神経細胞における、神経刺激物質としてグルタミン酸を投与した場合の、神経細胞内カルシウム濃度を測定結果を解析する。この実験により、通常の初代培養神経細胞と人工脳虚血状態において生存することが可能であった培養神経細胞におけるグルタミン酸やNMDAに対する反応性の差異について検討を加えることとする。また、同様の低酸素傷害モデルを使用し、神経細胞保護療法を行った各生存細胞に対し、GAD65, GAD67に対する免疫組織学的染色を行い、薬物及び低温療法のGABA作動性神経細胞に対する特異性を明らかにする。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
現在研究途中であり、その研究の遂行に必要不可欠である。
培養実験のための器具、材料、試薬。
学会参加をはじめとする調査、資料収集旅費、研究打合せ旅費。
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