| 研究課題/領域番号 |
23592382
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| 研究機関 | 名古屋市立大学 |
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研究代表者 |
梅本 幸裕 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (80381812)
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| 研究分担者 |
郡 健二郎 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (30122047)
佐々木 昌一 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (50225869)
窪田 裕樹 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (10347403)
水野 健太郎 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (70448710)
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| キーワード | Numb / Numb-like / 造精機能障害 / 男性不妊症モデルマウス / 停留精巣 / siRNA |
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| 研究概要 |
Numb/Numb-likeのノックダウン実験
平成23年度で構築したNumbおよびNumb-likeに対するsiRNA発現ベクターを用いてin vivoでのNumb/Numb-likeのノックダウン実験を行った。ラットは4～１２週齢雄Sprague-Dawleyラットを用い、以下の４群を作成。Group A: Numb siRNA発現ベクター導入群、Group B: Numb-like siRNA発現ベクター導入群、Group C: Numb siRNA発現ベクターとNumb-like発現ベクターを両方導入群、Group D: ネガティブコントロール siRNA発現ベクター導入群の4群に分けた。ベクター量の作成には限界があり、また精巣網より30ゲージ針を用いて注入は技術的に難度が高かった。そのため精巣に直接注入し、その後、精巣にエレクトロポレーション法にて遺伝子導入を行った。右精巣はコントロールとして用いる。
導入後２週後に精巣を摘出し以下の検討を行った。1.ベクター導入効率・発現期間の検討:in vivoでベクターを導入した精巣を、組織学的に検討し、ベクター導入効率と、経時的な効果発現を評価する。また、エレクトロポレーションや、ベクター導入の影響によるアポトーシスの誘導をTUNEL染色にて評価する。2.精巣におけるNumb/Numb-like遺伝子機能の検討: siRNA発現ベクターを導入した精巣で、Numb/Numb-likeが精細胞の分化に及ぼす影響を組織学的に評価した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
NumbおよびNumb-likeの局在が判明し、経時的変化がとらえられた。
また、siRNAを使用してのノックダウンにおいて精母細胞、精子細胞でのそれぞれの分化が確認され、精子形成過程のそれぞれの遺伝子の役割を示唆する結果と考えられた。
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| 今後の研究の推進方策 |
精子形成サイクルの期間から考えると、siRNAを導入してからより早期の時期での精細管への影響を観察する必要がでてきた。そうすることにより、これらの遺伝子が精子形成のどういった時期、期間に作用を及ぼしているのかが、観察可能と考えられる。
今後はsiRNAを導入後１，３，５，７，１４日での精子形成への影響を観察する必要が出てきた。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
平成２３，２４年同様に、siRNAを導入を精巣に導入する。その際siRNAを導入後１，３，５，７，１４日での精巣組織が必要になる。
今までと同様に精巣内へ導入するため、SDラット、siRNAのベクターの作成、精巣組織の免疫染色を行い、導入初期における精子形成への影響を観察していく。
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