| 今後の研究の推進方策 |
In vitroの実験系を確立して、アルコールによるセルトリ細胞のオートファジーをブロックする方策を以下のように検討する。42GPA9マウスのセルトリ細胞株を10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/mL penicillin, and 100 μg/mL streptomycin含有のEagle mediumで5%CO2インキュベーターにて培養する。アルコールの直接的影響を検討するために3% FBS含有のダルベッコ緩衝液でエタノールを2.5, 5, 10, 25mMに希釈した溶液でそれぞれ24, 48, 72時間培養する。生存率はCell-Titer Blue Cell Viability Assay Kitを用いて行う。Beclin-1, LC-3, LAMP-2でオートファジーの検索を、酸化ストレスマーカー8-OHdG, HNE、脂肪の同定はOil Red O染色で行う。オートファジー阻害実験：クルクミン、マンゴスチンの至適濃度はCell Viability Assayで決定する。エタノール添加培養によりオートファジーを誘導し、至適濃度のクルクミン、マンゴスチンを添加、オートファジー阻害効果の評価はBeclin-1, LC-3, LAMP-2抗体を用いたWestern blotで行う。Caspase活性測定によりオートファジーのシグナル伝達経路が推測された場合には、そのCaspase阻害剤を添加して確認する。
In vivoで急性アルコール障害ラットモデルを作製して証明する。クルクミン、マンゴスチンをそれぞれ80mg/Kg ~160mg/Kgまでの濃度を振り分けて経口投与する。投与期間は経時的に８週までとする。治療効果およびオートファジーの評価はH.E染色、Beclin-1, LC-3, LAMP-2の組織学的、生化学的検索による。
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