| 研究課題/領域番号 |
23592671
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| 研究機関 | 熊本大学 |
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研究代表者 |
鷺島 克之 熊本大学, 医学部附属病院, 助教 (40336235)
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| 研究分担者 |
木下 順弘 熊本大学, 大学院生命科学研究部, 教授 (30195341)
蒲原 英伸 熊本大学, 大学院生命科学研究部, 准教授 (90398222)
廣佐古 進 熊本大学, その他の研究科, 助教 (70432995)
境 恵祐 熊本大学, 医学部附属病院, 助教 (10433038)
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| キーワード | ARDS / microRNA / Exosome / SIRS |
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| 研究概要 |
Exosomeのpurityとキットによる回収効率の評価のために、血清からExoQuick Exosome Precipitation Solution (SBI)により分離されたexosomeを電子顕微鏡にてmicrovesicleを確認した。さらにexosomeの細胞表面マーカーであるCD63をWestern blottingにて同定した。また、mirVana miRNA isolation kitにて抽出したexosomel microRNAsをBionalizerを用いてサイズの評価を行ったところ、25 nucloetideの大きさにピークを認めるsmall RNAを確認できた。以上により、Exosomeとexosomal microRNAの純度とその回収効率が種々の解析に応用できることを明らかにした。現在、ARDSの患者血清を回収しストックしており、exosomeおよびexosomal microRNAを用いて、Real time RT-PCRやmicroRNA chip等の解析を行いARDSに関連したbiomarkerの検索を行っている途中である。Exosomeの中には蛋白・核酸などが混在して存在しており、endocytosisにて細胞内に取り込まれる。exososomeは細胞間の情報伝達として機能している可能性がある。今後、exosomeが機能的であるかどうか、肺胞上皮由来のA549細胞、白血球由来のTHP-1細胞を用いてexogenic exoxomeの刺激によりいかに細胞が変化(細胞死、増殖、サイトカイン産生増加など)するのかを検証する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ARDSに関連したExosomal microRNAの解析を進めていくために、安定したExosomeの精製とexosomal microRNAの分離が必要条件となってくる。この実験系を確立するために、血清から分離したExosomeを用いて電子顕微鏡とWestern blottingにより、その純度が良好であることが確認できた。また、Bioanalyzerを用いてexsosomal microRNAの純度が次の解析に応用できることを確認した。現在まで回収保存しているARDS患者血清からexosomal microRNAの精製を行い、新たなbiomarkerの同定を行っていく。
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| 今後の研究の推進方策 |
ARDSの病態メカニズムとして、IL-8やMMP-8などの炎症誘導因子との関連が明らかにされている。ICUにおいてARDSの発症は敗血症が関連することが多い状況にあるが、ARDS発症なしの敗血症も存在する。この相違点を血清サンプルからのサイトカイン等の炎症関連因子との比較を行っていく。以上の結果とmicroRNAとの発現のmicroarray等による解析により関連性を追及し、ARDSにおける新たなbiomarkerの検索に役立てていく。
Exosomeの中には蛋白・核酸などが混在して存在しており、endocytosisにて細胞内に取り込まれる。exososomeは細胞間の情報伝達として機能している可能性がある。exosomeが機能的であるかどうか、肺胞上皮由来のA549細胞、白血球由来のTHP-1細胞を用いてexogenic exoxomeの刺激によりいかに細胞が変化(細胞死、増殖、サイトカイン産生増加など)するのかを検証する。
また、exosomal microRNAの意義について、細胞内への遺伝子導入もしくはinhibitor等を用いて解析していく。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
ARDSは過剰な炎症を惹起するため、炎症局所の喀痰と全身に影響を及ぼす血液との比較は重要である。したがって、血液・気管支液からexosomeの分離抽出を引き続き継続する。
このための、分離キット、mRNAおよびmicroRNAの測定のための試薬の購入が必要である。また、新たなbiomarkerを検索する上で、microRNAのmicro arrayが必要になってくる。情報量が膨大であるため、正確な検体採取とその比較する検体の選定が重要である。したがって、数回の予備実験を繰り返すこととなる。研究成果の発表および情報収集のための国内外ので学会参加が必要である。
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