| 研究課題/領域番号 |
23592697
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| 研究機関 | 岐阜大学 |
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研究代表者 |
手塚 建一 岐阜大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (50236973)
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| キーワード | iPS細胞 / 歯髄細胞 / センダイウイルスベクター / Zinc Finger Nuclease / Human Leucocyte Antigen |
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| 研究概要 |
本年度は、前年度までにセンダイウイルスベクターによって樹立したiPS細胞の染色体検査をおこない、異常が生じていない事を確かめた。また、無血清培地で培養した歯髄細胞からも、センダイウイルスベクターを用いてiPS細胞誘導をおこない複数のiPS細胞ラインを得た。その効率は、血清入りの培地をもちいて樹立した場合と比べて、ほぼ同程度であった。樹立されたiPS細胞について、未分化マーカーの発現解析と、テラトーマ形成による多分化能を確かめた。
これらの結果をふまえて、JSTの山中iPS細胞特別プロジェクトの中で提案した、人白血球抗原(Human Leucocyte Antigen, HLA）ハプロタイプホモiPS細胞を樹立する手段として、DNAVEC社のセンダイウイルスベクターを使用することができると結論し、日本人における出現率５位のHLAハプロタイプホモ細胞（DP263）から、iPS細胞を樹立した。
さらに、日本人での出現度２位のHLAハプロタイプをホモで持つiPS細胞をを得るために、HLAローカスの２ローカスがホモで、Aローカスのみがヘテロの歯髄細胞を選び、Zinc FInger Nuclease (ZFN)による特異的変異導入を試みた。現在までに、ZFN１種類の設計が終了し、来年度は２種類目の設計をおこなう。これらのZFNを発現させた歯髄細胞から直接iPS細胞を誘導するために、センダイウイルスベクターを使用する。ベクター導入後の、スクリーニングにはHLA特異的な抗体による染色と、セルソーターを利用するが、本年度はスクリーニング用の抗体の検討と、ラベリングをおこなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
当初、センダイウイルスベクターの評価を目標としていたが、歯髄細胞を用いた場合には、レトロウイルスベクター、プラスミドベクター、産総研センダイウイルスベクター、DNAVEC社センダイウイルスベクターのすべてで、0.2%前後という高い効率で、iPS細胞誘導ができた。そのため、われわれは供給が安定しているDNAVEC社のベクターをスタンダードとして用いている。研究歴１年未満の大学院生を含めて、複数の実験者によって、多少の効率のばらつきはあっても、iPS細胞誘導ができる事が確認された。さらに、無血清培地で樹立した歯髄細胞からもiPS細胞誘導を試み、血清入り培地で樹立した細胞とほぼ同じ効率でiPS細胞を樹立できた。この事は、センダイウイルスベクターの感染効率が血清の有無に左右されない事を示しており、今後のiPS細胞樹立方法として有効である事を示している。
このように、歯髄細胞とセンダイウイルスベクターの組み合わせの有用性が確認できたことより、われわれが山中教授と共同で進めてきた、HLAハプロタイプホモiPS細胞の樹立にも、センダイウイルスベクターを積極的に利用しようと考えている。当初、２種類のみ見つかっていたHLAハプロタイプホモ歯髄細胞からは、すでにiPS細胞が樹立されているが、本年度３番目のHLAハプロタイプホモ歯髄細胞からもiPS細胞が樹立できた。また、まだ見つかっていないHLAハプロタイプについても、人工的に変異を導入して擬似的にHLAハプロタイプホモiPS細胞を樹立方法を試みており、進展状況としては予定した以上の成果を上げている。これらの成果については来年度中に論文にまとめる予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
（１）無血清培地で培養した歯髄細胞から誘導したiPS細胞の解析を終わらせ、論文にまとめる。
（２）設計済みのZFNを用いて、HLAローカスの特異的な変異導入を試みる。しかし、予備実験によりZFNの活性が充分ではない可能性があり、特異性を下げたZFNの再設計を予定している。その予算として、本年度の予算を一部繰り越してある。
（３）ZFNを導入した歯髄細胞のうち、標的とするHLAの発現が低下している細胞をセルソーターを用いて分取し、センダイウイルスベクターによるiPS細胞誘導を試みる。iPS細胞の誘導はセミクローナルと考えられているが、実際にHLAの表現型と遺伝子型を確認して、モノクローナルにiPS細胞誘導が起きているかを確認する。
（４）目的とする疑似HLAハプロタイプホモiPS細胞が得られた場合には、染色体検査（その他：役務に計上）をおこなって、目的以外の染色体異常が起きていないかを確認する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
昨年度おこなったZFN設計が、予想していたよりも困難であったため、追加のZFN設計が必要となった。昨年度でJSTの山中iPS細胞特別研究プロジェクトが終了した際に、本課題の研究費の使用を控えて、次年度の研究を確保した形となる。繰り越し金（646,371円）を使い、追加のZFN設計をおこなう。
また、消耗品費としては、センダイウイルスベクターキット（Cytotune-iPS）や、間葉系幹細胞用培地、Primate ES培地、プライマー、抗体、遺伝子解析用試薬等の購入にもちいる。
本年は、学会発表や論文発表も増える予定であり、国外でも成果を発表するため、出張旅費や論文発表経費を使用する。
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