| 研究課題/領域番号 |
23592717
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
BHAWAL Ujjal 日本大学, 歯学部, 助教 (50433339)
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| 研究分担者 |
佐藤 冬樹 弘前大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (60400131)
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| キーワード | エピジェネティク解析 / 転写因子 / DEC2 |
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| 研究概要 |
低酸素応答レポーター5HRE-Luciferaseを用いた低酸素細胞の光イメージングHIF-1活性化領域を可視化、定量化し経時的な変化を観察するHIF-1の結合領域であるHREを5つ繋いだプロモーターの下流に化学発光酵素ルシフェラーゼをコードしたレポータープラスミド (5HRE-Luciferase) を安定に保持する癌細胞株を構築した。
癌細胞株にLuciferase発現ベクターを導入し、選択培地を用いて遺伝子導入株を選択した。単離した安定発現細胞株の低酸素応答を確認するため、低酸素および有酸素条件下培養後におけるルシフェラーゼ活性比を確認し、低酸素で数百倍の活性を有する株を選択した。選択したHRE-Lucを皮下移植し、腫瘍内の化学発光を、好感度CCDカメラを搭載した動物用光イメージング装置IVIS spectrum (Caliper社) を用いて経時的に観察した。また、経時的な低酸素関連遺伝子(HIF-1、DEC)の発現を免疫組織学的に解析し、また組織よりRNAを抽出しリアルタイムPCR法より解析した。
癌を皮下移植した後、低酸素領域をイメージングするため、融合タンパク質1 nmolをマウスに投与し、IVIS Lumina II を用いて、経時的に蛍光イメージを観察した。また、経時的な低酸素関連遺伝子 の発現を免疫組織学的に解析し、また組織よりRNAを抽出しリアルタイムPCR法より解析した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
DEC2ノックアウトマウスの作成はうまくいったため、エピジェネティク解析により他の低酸素関連遺伝子についても解析可能であり、影響の強い遺伝子に着目できる。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成24年度と同様な手法を用いて、レポータープラスミド (5HRE-Luciferase) を安定に保持する癌細胞株を移植したマウスに放射線照射し、低酸素領域および低酸素関連遺伝子の発現への放射線照射の影響を解析する。低酸素領域の観察は、In vivo光イメージングにて観察し、融合タンパク質PTD-ODD を用いた分子イメージングプローブを用いた観察も行う。また、低酸素関連遺伝子の発現を免疫組織学的および分子生物学的に解析する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
該当なし
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