ＣＣＮファミリー間のネットワーク形成による筋肉内異所性骨化の分子機構の解明

2012 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 23592732
• 研究機関: 岡山大学
• 研究代表者: 西田 崇 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (30322233)
• 研究分担者: 滝川 正春 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (20112063) ; 久保田 聡 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 准教授 (90221936) ; 服部 高子 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (00228488) ; 青山 絵理子 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (10432650)
• キーワード: 筋肉内異所性骨化 / マウス筋芽細胞 / CCN2 / CCNファミリー / 筋管形成 / 骨芽細胞様変化

研究概要

マウス筋芽細胞株C2C12細胞に炎症性シグナルとしてTNFαを作用させると、CCNファミリーの古典メンバーの中でCCN2のみがTNFαによって発現誘導されることを明らかにした。またCCN2がBMP2と結合し、その作用を修飾することが報告されており、これらのことから、我々はCCNファミリー分子群の中でCCN2が筋肉内異所性骨化に深く関与していると考えた。平成23年度ではC2C12細胞を用いて、CCN2の筋芽細胞に対する作用を明らかにした。これらの結果をもとに平成24年度では実際のマウスの筋組織から筋芽細胞を単離し、CCN2における作用を解析すると共にCCN2欠損マウス由来の筋芽細胞の細胞増殖や筋管細胞への分化に与える影響及び石灰化に対する影響を解析した。
(１) マウスの菲腹筋から単離した筋芽細胞にTNFα刺激を加えると、C2C12細胞と同様にCCN2の産生量の増加が見られた。(２) マウス筋芽細胞にCCN2を添加すると、筋管細胞のマーカーであるMyosin heavy chain (MHC)の遺伝子発現量が低下した。(３) CCN2欠損マウスから単離した筋芽細胞による筋管形成能は野生型マウス由来の細胞よりも亢進した。しかし、MyoDやMHCなどの筋管細胞のマーカー遺伝子の発現量は逆に低下した。(４) BMP2によるCCN2欠損マウス由来筋芽細胞のアルカリホスファターゼ(ALP)染色のレベルは野生型マウス由来筋芽細胞に比べて上昇した。(５) CCN2欠損マウス由来筋芽細胞において骨芽細胞のマーカー分子であるALP及びOsterixの遺伝子発現レベルは野生型マウス由来筋芽細胞に比べて上昇した。
これらの結果からCCN2は筋芽細胞において調和のとれた増殖及び分化に必要であるだけでなく、異所性骨化の抑制にも関わっていることが示唆された。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

平成24年度の研究目的はC2C12細胞のような細胞株を用いたCCN2の作用を検討するのではなく、実際のマウスの筋組織から単離した筋芽細胞によるCCN2の作用を調べることであるから、この点に関しては順調に進展している。また、CCN2欠損マウスからも筋芽細胞を単離し、CCN2欠損マウス由来筋芽細胞による筋管形成やBMP2刺激による骨芽細胞様変化に対する影響を解析できた点は当初計画よりも進展しているのかもしれない。しかしながら、研究計画に含まれている動物実験に関しては遅れているため、総合的に判断して本課題は概ね順調に進展していると考えている。

今後の研究の推進方策

平成23年度はC2C12細胞におけるCCN2の作用を中心に行い、平成24年度はマウス筋芽細胞における解析を中心に行った。今後はこれらの結果をもとに動物実験を中心としたCCN2の異所性骨化における役割を解析していく必要があるが、この時点でこれまでの成果をまとめることも必要である。よって、今後はこれまでの成果をまとめつつ動物実験を行っていく予定である。

次年度の研究費の使用計画

当初計画では平成24年度に市販のマトリゲル内にBMP2、CCN2あるいはその両者を混合した後、マウス腹部皮下に注入し、異所性骨化がどのように進行していくかという動物実験を計画していた。この実験はマウス下腿に人為的に異所性骨化を引き起こさせる動物実験の前段階としての位置付けの動物実験と当初考えていたが、in vitroの筋芽細胞におけるCCN2の作用が明らかとなった時点で、この動物実験を行っても、CCN2の筋肉内異所性骨化における役割を解明するのに十分な成果が得られないと考えた。そのため、当初計画を変更したことで当該研究費が生じたが、平成25年度には実際の筋肉内に異所性骨化を引き起こさせる実験に着手する予定であるため、平成25年度に請求する研究費と当該研究費を合わせて研究計画を実施する予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Novel chondrogenic and chondroprotective effects of the natural compound harmine. (2013)
  • 著者名/発表者名: Hara, E. S., Ono, M., Kubota, S., Sonoyama, W., Oida, Y., Hattori, T., Nishida, T., Furumatsu, T., Ozaki, T., Takigawa, M. and Kuboki, T
  • 雑誌名: Biochimie 巻: 95 ページ: 347-381
  • DOI: 10.1016/j.biochi.2012.10.016. Epub 2012 Oct 29.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Anti-fibrotic effect of CCN3 accompanied by altered gene expression profile of the CCN family. (2013)
  • 著者名/発表者名: Abd El Kader, T., Kubota, S., Janune, D., Nishida, T., Hattori, T., Aoyama, E., Perbal, B., Kuboki, T. and Takigawa, M.
  • 雑誌名: J. Cell Commun. Signal. 巻: 7 ページ: 11-18
  • DOI: 10.1007/s12079-012-0180-4. Epub 2012 Oct 14.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Impaired glycolytic metabolism causes chondrocyte hypertrophy-like changes via promotion of phospho-Smad1/5/8 translocation into nucleus. (2013)
  • 著者名/発表者名: Nishida, T., Kubota, S., Aoyama, E. and Takigawa, M.
  • 雑誌名: Osteoarthritis Cartilage, 巻: 21 ページ: 770-709
  • DOI: 10.1016/j.joca.2013.01.013. Epub 2013 Feb 4.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Novel role of miR-181a in cartilage metabolism. (2013)
  • 著者名/発表者名: Sumiyoshi K, Kubota S, Ohgawara T, Kawata K, Abd El Kader T, Nishida T, Ikeda N, Shimo T, Yamashiro T, Takigawa M
  • 雑誌名: J Cell Biochem 巻: in press ページ: in press
  • DOI: 10.1002/jcb.24556.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Roles of heterotypic CCN2/CTGF-CCN3/NOV and homotypic CCN2-CCN2interactions in expression of the differentiated phenotype of chondrocytes. (2012)
  • 著者名/発表者名: Hoshijima M, Hattori T, Aoyama E, Nishida T, Yamashiro T, Takigawa M.
  • 雑誌名: FEBS J 巻: 279 ページ: 3584-3597
  • DOI: 10.1111/j.1742-4658.2012.08717.x. Epub 2012 Aug 28.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Role of low-density lipoprotein receptor related protein 1 (LRP1) in CCN2/connective tissue growth factor (CTGF) protein transport in chondrocytes. (2012)
  • 著者名/発表者名: Kawata., K., Kubota, S., Eguchi, T., Aoyama, E., Moritani, N., Kondo, S., Nishida, T., Takigawa, M.
  • 雑誌名: J Cell Sci 巻: 15 ページ: 2965-2972
  • DOI: 10.1242/jcs.101956.
  • 査読あり
• [学会発表] 軟骨細胞におけるCCN2発現の低出力超音波(LIPUS)による誘導。 (2013)
  • 著者名/発表者名: 西田 崇、久保田聡、青山絵理子、山中信康、滝川正春
  • 学会等名: 第12回日本再生医療学会総会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 20130321-20130323
• [学会発表] 軟骨細胞におけるCCN2発現の低出力超音波(LIPUS)による誘導。 (2013)
  • 著者名/発表者名: 西田 崇、久保田聡、青山絵理子、山中信康、滝川正春
  • 学会等名: 第26回日本軟骨代謝学会
  • 発表場所: 大阪
  • 年月日: 20130301-20130302
• [学会発表] Cartilage regenerative effects of CCN2 independent modules. (2013)
  • 著者名/発表者名: Abd El Kdaer, T., Kubota, S., Nishida, T., Hattori, T., Aoyama, E., Janune, D., Kuboki, T., Takigawa, M.
  • 学会等名: 第26回日本軟骨代謝学会
  • 発表場所: 大阪
  • 年月日: 20130301-20130302
• [学会発表] Rab14 GTPaseのCCN2/CTGF結合因子としての同定と、これらの相互作用が軟骨細胞の小胞輸送に及ぼす役割。 (2013)
  • 著者名/発表者名: 星島光博、服部高子、青山絵理子、西田 崇、山城 隆、滝川正春
  • 学会等名: 第26回日本軟骨代謝学会
  • 発表場所: 大阪
  • 年月日: 20130301-20130302
• [学会発表] 軟骨細胞のエネルギー代謝を支えるCCN2/CTGF。 (2013)
  • 著者名/発表者名: 前田 彩、久保田聡、三宅由晃、河田かずみ、西田 崇、服部高子、森谷徳文、川木晴美、Karen M Lyons、飯田征二、滝川正春
  • 学会等名: 第26回日本軟骨代謝学会
  • 発表場所: 大阪
  • 年月日: 20130301-20130302
• [学会発表] Roles of the heterotypic CCN2-CCN3 and homotypic CCN2-CCN2 interactions in matrix synthesis in chondrocytes. (2012)
  • 著者名/発表者名: Hoshijima, M., Hattori, T., Aoyama, E., Nishida, T., Yamashiro, T., Takigawa, M.
  • 学会等名: 2012 The American Society for Cell Biology Annual Meeting
  • 発表場所: San Francisco, California, USA
  • 年月日: 20121215-20121219
• [学会発表] Roles of CCN2 in energy metabolism in chondrocytes. (2012)
  • 著者名/発表者名: Maeda, A., Kubota, S., Miyake, Y., Kawata, K., Nishida, T., Hattori, T., Moritani, N., Kawaki, H., Lyons, K.M., Iida, S., Takigawa, M.
  • 学会等名: 2012 The American Society for Cell Biology Annual Meeting
  • 発表場所: San Francisco, California, USA
  • 年月日: 20121215-20121219
• [学会発表] CCN2とOPGの分子間相互作用による新たな破骨細胞分化制御機構。 (2012)
  • 著者名/発表者名: 青山絵理子、久保田聡、西田 崇、滝川正春
  • 学会等名: 第85回日本生化学会大会
  • 発表場所: 福岡
  • 年月日: 20121214-20121216
• [学会発表] 軟骨細胞のエネルギー代謝におけるCCN2/CTGFの役割。 (2012)
  • 著者名/発表者名: 前田 彩、久保田聡、三宅由晃、河田かずみ、西田 崇、服部高子、森谷徳文、川木晴美、Karen M Lyons、飯田征二、滝川正春
  • 学会等名: 第35回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 福岡
  • 年月日: 20121211-20121214
• [学会発表] 軟骨細胞の代謝システムにおけるCCN2の役割。 (2012)
  • 著者名/発表者名: 前田 彩、久保田聡、三宅由晃、河田かずみ、服部高子、西田 崇、森谷徳文、川木晴美、Karen M Lyons、飯田征二、滝川正春
  • 学会等名: 第33回岡山歯学会学術集会
  • 発表場所: 岡山
  • 年月日: 20121125-20121125
• [学会発表] 乳酸共存下での細胞内ATP量の減少は軟骨細胞の肥大化を引き起こす。 (2012)
  • 著者名/発表者名: 西田 崇、久保田聡、青山絵理子、滝川正春
  • 学会等名: 第54回歯科基礎医学会
  • 発表場所: 郡山
  • 年月日: 20120914-20120916
• [学会発表] CCN2/CTGF欠損が軟骨細胞のエネルギー代謝に及ぼす影響。 (2012)
  • 著者名/発表者名: 前田 彩、久保田聡、服部高子、西田 崇、飯田征二、滝川正春
  • 学会等名: 第54回歯科基礎医学会
  • 発表場所: 郡山
  • 年月日: 20120914-20120916
• [学会発表] CCN2-OPG間相互作用による破骨細胞形成新規制御機構の解明。 (2012)
  • 著者名/発表者名: 青山絵理子、久保田聡、西田 崇、滝川正春
  • 学会等名: 第54回歯科基礎医学会
  • 発表場所: 郡山
  • 年月日: 20120914-20120916
• [学会発表] Effect of CCN2 on FGF2-induced proliferation of and MMP-9 and -13 productions by chondrocytes. (2012)
  • 著者名/発表者名: Nishida, T., Kubota, S., Aoyama, E., Janune, D., Maeda, A., Takigawa, M.
  • 学会等名: 22nd IUBMB-37th FEBS Congress
  • 発表場所: Sevilla, Spain
  • 年月日: 20120904-20120909
• [学会発表] Effect of CCN2 independent modules on chondrogenic and osteoblastic cells. (2012)
  • 著者名/発表者名: Abd El Kdaer, T., Kubota, S., Nishida, T., Hattori, T., Aoyama, E., Janune, D., Kuboki, T., Takigawa, M.
  • 学会等名: 第30回日本骨代謝学会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 20120719-20120721
• [学会発表] 乳酸共存下での細胞内ATP量の減少は軟骨細胞の肥大化を引き起こす。 (2012)
  • 著者名/発表者名: 西田 崇、久保田聡、高嶋壮一朗、滝川正春
  • 学会等名: 第30回日本骨代謝学会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 20120719-20120721
• [学会発表] CCN2 modules; Independent and combinational effect on chondrocytic cells. (2012)
  • 著者名/発表者名: Abd El Kdaer, T., Kubota, S., Nishida, T., Hattori, T., Aoyama, E., Janune, D., Kuboki, T., Takigawa, M.
  • 学会等名: 第3回骨バイオサイエンス研究会
  • 発表場所: 岡山
  • 年月日: 20120714-20120714
• [学会発表] The CCN2-inducer Harmine promotes chondrogenesis and protection against TNFα-induced inflammation. (2012)
  • 著者名/発表者名: Hara, E., Ono, M., Kubota, S., Sonoyama, W., Oida, Y., Hattori, T., Nishida, T., Furumatsu, T., Ozaki, T., Takigawa, M., Kuboki, T
  • 学会等名: 90th General Session & Exhibition of the IADR
  • 発表場所: Iguacu falls, Brazil
  • 年月日: 20120620-20120623
• [学会発表] Effect of CCN2 independent modules on chondrocytic cells. (2012)
  • 著者名/発表者名: Abd El Kader, T., Kubota, S., Nishida, T., Hattori, T., Aoyama, E., Janune, D., Kuboki, T., Takigawa, M.
  • 学会等名: 90th General Session & Exhibition of the IADR
  • 発表場所: Iguacu falls, Brazil
  • 年月日: 20120620-20120623
• [備考] 岡山大学歯学部口腔生化学分野
  • URL: www.dent.okayama-u.ac.jp/seika/