| 研究課題/領域番号 |
23592823
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
大堀 ことは 北海道大学, 大学病院, 医員 (10374539)
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| 研究分担者 |
横山 敦郎 北海道大学, 歯学研究科(研究院), 教授 (20210627)
小松原 浩実 北海道大学, 大学病院, 助教 (50221247)
山本 悟 北海道大学, 歯学研究科(研究院), 助教 (10344524)
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| キーワード | 培養人工骨 |
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| 研究概要 |
培養人工骨の作製：
１）骨髄幹細胞の骨芽細胞への誘導
基礎実験として、Maniatopoulosらの方法に準じて、ラットの大腿骨より骨髄幹細胞を採取し、初代培養を行った。付着した細胞を回収した後、1、2、3、4週間培養し、アルカリフォスファターゼ（ALP）活性、DNA量、Ca（カルシウム）量を測定し、骨形成が順調に行われていることを確認した。培養人工骨作製として、骨髄幹細胞を多孔質HAP気孔内で培養し、デキサメサゾンで誘導することにより、骨髄幹細胞から骨芽細胞へ分化させていくのだが、途中段階である。また、骨誘導再生(Guided bone regeneration: GBR)法は、細胞の通過を遮る構造を有する生体内吸収性あるいは非吸収性の膜を利用して、必要とする骨組織が形成されるための空隙を確保するとともに、周囲からの結合組織の侵入を遮断し、骨芽細胞を膜と既存骨で形成される空隙内へ効果的に誘導することによって、骨形成を促す方法である。しかし、GBR膜による外部からの完全な細胞成分の遮断を行うと、スペース内に骨芽細胞を誘導できないことが推察されるため、ブロック上で骨髄幹細胞を培養し、骨芽細胞へ誘導した培養人工骨を用いる。この培養人工骨を用いることにより、膜によって完全に外部から遮断され、細胞成分が存在しない状況下においても十分な骨形成が可能となることが期待される。
埋入材料：直径5㎜、厚さ2㎜、気孔率50％、1,200℃で焼成した多孔質HAPを埋入材料として用い、これを被覆してGBR用膜として使えるよう、吸収性膜であるポリ乳酸(PLA)膜(シート)を賦形した。GBR用膜として骨組織が形成されるための空隙を確保するとともに、周囲からの結合組織の侵入を遮断するため、PLA膜は熱成形する必要がある。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
H24年度の計画では、培養人工骨を作製し、これを用いて動物実験を行う予定だったが、まだ、培養人工骨作製、GBR用膜の賦形の途中段階である。したがって、評価は遅れている。理由は、培養実験に手間取ったためである。
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| 今後の研究の推進方策 |
培養人工骨の作製：ラット大腿骨から採取した骨髄幹細胞を、多孔質HAP内で培養し、骨髄幹細胞から骨芽細胞へ分化させ、２、４週間培養後、ラット軟組織へ埋入する。4週間後に摘出し、骨組成のマーカーであるオステオカルシン（Oc）のタンパクの発現を測定する。
材料の埋入：ラット頭頂骨骨膜下に上記より決定された条件下で作製された培養人工骨を用い、以下の４群に関する実験を行う。実験期間は、２，４，８，１６週とする。また、実験期間中、２％カルセインと５％オキシテトラサイクリンで骨組織を標識する。
埋入方法：①HAPブロック埋入群②培養人工骨埋入群③HAPブロック＋PLA膜埋入群
④培養人工骨＋PLA膜埋入群 (培養人工骨は２週培養のものを使用する。)
データの解析：安楽死後に摘出した埋入部位である頭蓋骨を試料とし、一部は、脱灰標本とし、ヘマトキシリンーエオジン染色（HE染色）を施し、HAPブロックおよびPLA膜周囲の組織反応を病理組織学的に検索する。さらに、Tartrate-resistant acid phosphatase(TRAP)染色を施し、骨改造を定量的に評価する。また、一部の試料は、固定後、Villanueva bone染色を施し、非脱灰研磨標本を作製する。これらの研磨標本から、HAPブロックおよび培養人工骨周囲における新生骨量を蛍光顕微鏡で観察するとともに、画像解析装置で計測し、組織計量学的検索を行う。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
平成23年度、24年度の実施が、計画より遅れているため未使用額が生じた。平成25年度において予定通り、平成23年度、平成24年度の計画分の購入に充てる予定である。
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