独創的な手法を用いたヒトｉＰＳ細胞由来の歯形成細胞群の濃縮法の樹立

2013 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 23593038
• 研究機関: 鹿児島大学
• 研究代表者: 長谷川 大子 鹿児島大学, 医歯(薬)学総合研究科, 客員研究員 (00295271)
• 研究分担者: 佐藤 正宏 鹿児島大学, 医用ミニブタ先端医療開発研究センター・遺伝子発現制御学分野, 教授 (30287099) ; 齊藤 一誠 新潟大学, 医歯学系, 准教授 (90404540) ; 山崎 要一 鹿児島大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (30200645) ; 早崎 治明 新潟大学, 医歯学系, 教授 (60238095) ; 野口 洋文 独立行政法人国立病院機構(千葉東病院臨床研究センター), 外科・移植再生学, 研究員 (50378733) ; 齊藤 陽子 新潟大学, 医歯学総合病院, 助教 (30404487) ; 稲田 絵美 鹿児島大学, 医学部・歯学部附属病院, 助教 (30448568)
• キーワード: iPS細胞 / ameloblast / 遺伝子工学

研究概要

本研究課題では、iPS細胞をヌードマウス皮下に移植して得られた奇形腫（様々な分化細胞から成る）から、in vitro 組織再構成法を用いて、歯幹細胞、ameloblast、odontoblastなどの歯関連細胞群のみを選択的に濃縮し、最終的に歯関連細胞株として樹立することを目的とした。
具体的には、まず、①歯関連細胞（ameloblast、odontoblast）に特異的に蛍光タンパクを発現するプラスミドを構築して、乳歯歯髄細胞由来ヒトiPS 細胞へこれらプラスミドを遺伝子導入した後、薬剤で細胞を選別することにより、組換えiPSコロニーを取得する。②遺伝子導入されたヒトiPS細胞をヌードマウスへ移植し、生じた奇形腫を初代培養し、続く薬剤選別を通して、最終的にヒトiPS細胞由来の歯幹細胞、ameloblast、odontoblastなどの細胞株を樹立する。
残念ながら、組換えiPS細胞をヌードマウスに移植し、生じた奇形腫を初代培養し、歯関連細胞の出現を蛍光発現で検索した結果、蛍光を発現する細胞を観察することができなかった。おそらくin vivoで奇形腫が形成される過程で導入された遺伝子にはサイレンシングなどの遺伝子発現抑制がかかっていた可能性がある。そこで、遺伝子導入前のiPS細胞由来の奇形腫から得た初代培養細胞について、RT-PCR解析を行った。その結果、OCT3/4、NANOG、NESTIN、OC (osteocalcin)、DMP、DSPP、BGPの発現が認められた。また、奇形腫の初代培養細胞について、免疫組織学的解析を行ったところ、amelogenin遺伝子(AMELX)の存在も確認された。以上より、in vitroでiPS細胞から歯形成に係わる細胞群を分化誘導し、歯形成に係わるそれぞれの細胞株を樹立できる可能性が示された。

研究成果

• [雑誌論文] STO feeder cells are useful for propagation of primarily cultured human deciduous dental pulp cells in view of elimination of contaminated bacteria and promotion of cellular outgrowth (2013)
  • 著者名/発表者名: Murakami T, Saitoh I, Inada E, Kurosawa M, Iwase Y, Noguchi H, Terao Y, Yamasaki Y, Hayasaki H, Sato M
  • 雑誌名: Cell Medicine 巻: 6 ページ: 75-81
  • DOI: 10.3727/215517913X674234
  • 査読あり
• [雑誌論文] Site-targeted non-viral gene delivery by direct DNA injection into the pancreatic parenchyma and subsequent in vivo electroporation in mice. (2013)
  • 著者名/発表者名: Sato M, Inada E, Saitoh I, Ohtsuka M, Nakamura S, Sakurai T, Watanabe S
  • 雑誌名: Biotechnology 巻: 8 ページ: 1355-1361
  • DOI: 10.1002/biot.201300169
  • 査読あり
• [雑誌論文] Hela Cells Consist of Two Cell Types, as Evidenced by Cytochemical Staining for Alkaline Phosphatase Activity: A Possible Model for Cancer Stem Cell Study (2013)
  • 著者名/発表者名: Sato M, Kubota N, Inada E, Saitoh I, Ohtsuka M, NakamuraS, Sakurai T, Watanabe S
  • 雑誌名: Advances in Stem Cells 巻: 2013 ページ: 15pages
  • DOI: 10.5171/2013.208514
  • 査読あり
• [雑誌論文] Mosaic Expression of Pluripotency-Related Proteins Oct-3/4 and Alkaline Phosphatase in Human Pancreatic Carcinoma Cell PANC-1 (2013)
  • 著者名/発表者名: Sato M, Maeda S, Inada E, Saitoh I, Kubota N
  • 雑誌名: Advanced Studies in Biology 巻: 5 ページ: 157-172
  • DOI: http://www.doaj.org/doaj?func=issueTOC&isId=150538&uiLanguage=en
  • 査読あり
• [学会発表] Multipotency of juvenile human buccal epithelial cells. (2014)
  • 著者名/発表者名: T Murakami, I Saitoh, Y Iwase, E Inada, J Mastuyama, H Ohshima, H Hayasaki M Sato
  • 学会等名: AADR
  • 発表場所: North Carolina
  • 年月日: 20140318-20140321
• [学会発表] トランスポゾンPiggyBacシステムによる複数遺伝子のブタ細胞への同時導入 (2013)
  • 著者名/発表者名: 郡山美優，稲田絵美，齋藤一誠，三浦浩美，大塚正人，中村伸吾，桜井敬之，渡部聡，三好和睦，佐藤正宏
  • 学会等名: 第106回日本繁殖生物学会
  • 発表場所: 東京都
  • 年月日: 20130912-20130914
• [学会発表] ヒト乳歯歯髄由来iPS細胞樹立におけるフィーダー細胞選択の重要性 (2013)
  • 著者名/発表者名: 村上智哉, 齊藤一誠, 稲田絵美, 岩瀬陽子, 長谷川大子, 窪田直子, 松本祐子, 大島邦子, 岡 暁子, 山崎要一, 早崎治明
  • 学会等名: 第５１回日本小児歯科学会
  • 発表場所: 岐阜県
  • 年月日: 20130523-20130524