| 研究課題/領域番号 |
23618007
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
前田 明人 大阪大学, 産学連携本部, 特任教授 (50298882)
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| キーワード | 再生医学 / ｼｸﾞﾅﾙ伝達 / 細胞・組織 |
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| 研究概要 |
本研究では、間葉系幹細胞の細胞遊走を亢進させる化合物を見つけるために、天然物ライブラリーからボイデンチャンバー法を用いた探索を行い、間葉系幹細胞の遊走を活性化する低分子化合物を複数同定した。 前年度の研究によって、そのうちPL-70、PL-17とPL-C1は、比較的高い間葉系幹細胞の遊走活性を有し、細胞特異に強い感受性も認められた。そこで ３つの化合物について細胞内シグナル伝達系との関連性の解析を進めた。また、次年度の準備のため動物実験のためのモデル確立も併せて行った。 PL-70刺激による細胞遊走に関連するシグナル伝達系について、ウエスタンブロッティング法を用いて細胞内機能分子の活性化状況を調べたが、特定のプロテインキナーゼの影響を受けていなかった。 さらに化合物刺激した細胞染色像で細胞骨格の状況を調べたところ、細胞内アクチン骨格の発達に違いがあった。また、アクチン重合試験において、抑制効果が認められた。これらから、PL-70は細胞内アクチンに直接作用する可能性が示めされた。 次にPL-17とPL-C1刺激による細胞遊走に関連するシグナル伝達系について、細胞内機能分子の活性化状況を調べたところ、細胞内でチロシンリン酸化が起きていた。 キナーゼ阻害剤によって細胞遊走も抑制されるので、PL-17とPL-C1は特定のチロシンプロテインキナーゼの活性化を起こすことで細胞遊走を活性化する可能性が考えられた。さらに化合物を付加したビーズと相互作用するタンパクの分離分析を行い幾つかの分子に絞り込んだ。 以上の結果より、PL-70、PL-17と PL-C1について細胞遊走に関与している細胞内機能タンパクと相互作用している可能性が示唆された。 また、動物実験のためのモデル作製については、骨髄移植モデル、細胞遊走モデル、創傷治癒モデルを確立することができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
間葉系幹細胞の細胞遊走を亢進させる物質を見つけるために、天然物ライブラリーから探索を行い、間葉系幹細胞の遊走を活性化する低分子化合物を同定している。 そこで本研究では、同定した化合物の刺激による細胞遊走の特性とシグナル伝達を解析することでメカニズムを解明し、さらに、動物組織内での化合物刺激による幹細胞の遊走活性と組織再生の効果を調べることで再生医学へ応用するための基礎確立を目的とした。平成２４年度では、前年度に得られた化合物の細胞応答特性と細胞内シグナル伝達系を関係付けるため、細胞内機能分子の活性化状況を確認することと、動物実験のためのモデル作製の準備を目標とした。 PL-70、PL-17とPL-C1についてそれぞれ機能解析を進め、化合物刺激でのシグナル伝達系の解析を行った。 さらに化合物と相互作用する分子の探索を行い幾つかの分子に絞り込んだ。 また、動物実験についても骨髄移植モデル、ルシフェラーゼなどのトレーサー発現細胞移入モデル、創傷治癒モデルについてコントロール実験をおおむね実施できた。 以上の結果から、２４年度の予定目標をおおむね達成することができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
２４年度までの化合物による細胞遊走活性の解析を基にして、動物モデルを使って化合物の幹細胞遊走活性と創傷治癒の効果を調べる。得られた結果については学会や論文にて成果を発表する。 今年度の具体的な研究方針は、以下のとおりである。
１．細胞誘引作用の解析 先ず、化合物を尾静注または皮下注した動物において、その血中に間葉系幹細胞用の細胞が動員されてくるかをFACS解析やGFP発現骨髄移植モデルなどを使って検証する。 次に、動物体内の血流から化合物によって幹細胞誘引がされるのかを検証するために、ルシフェラーゼ発現間葉系幹細胞を尾静注した皮膚創傷モデルにて、化合物の投与での幹細胞の誘引作用を調べる。
２．誘引細胞の特定 マトリゲルプラグ法などで化合物に誘引された細胞をFACSや組織染色で特定する。具体的には、あらかじめトレーサー標識した幹細胞を検出することや、間葉系マーカーや線維芽細胞、血管細胞マーカーで分析する。
３．創傷治癒モデル 化合物の組織再生への影響を調べるため、全層欠損層からの創傷治癒モデルを作製し、化合物の単独塗布や足場分子との共存下で、創面積の縮小変化の計測、及び組織再生の質的な検討として組織染色法で評価する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
特許出願を優先させたため論文投稿準備が遅れ、２４年度の研究費に未使用分が生じたが、今年度行う予定の研究計画と併せて実施する。
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