研究課題
本研究では、レトロウイルスベクターを用いたGemininの過剰発現系やGemininの恒久的なshRNAノックダウンシステム系を確立した。これらの実験系を用いてGemininの発現量を低下させることにより造血前駆細胞や造血幹細胞の活性を増幅させることに成功した。また、Hoxa9が、従来知られてきた転写制御因子としての機能だけではなく、Roc1-Cul4a-Ddb1コアE3ユビキチンリガーゼ複合体と結合し、DNA複製ライセンス化制御因子であり幹細胞の未分化性維持因子でもあるGemininに対するE3ユビキチンリガーゼを構成し、Gemininタンパク質を分解に導くことを生化学的に証明し、Hoxa9の過剰発現による造血幹細胞や造血前駆細胞の活性化においてHoxa9によるGemininのユビキチン化を介したタンパク質発現減少が、重要な役割を果たしていることを明らかにした。さらに、もう一つのGemininに対するE3ユビキチンリガーゼであるポリコーム複合体1のサブストイキオメトリック構成要素であり、ポリコーム複合体1に対してGeminin結合部位を提供するScmh1を含むポリコーム複合体1が、Hoxa9/Hoxb4遺伝子の転写をヒストンH2A第119番リジン残基のモノユビキチン化を介して抑制することで直接的・間接的にGemininのタンパク質レベルを維持し造血ホメオスタシスを保っていることを明らかにした。そして併行して、造血幹細胞におけるGemininの発現動態を可視化するためにGeminin-EYFP(黄色蛍光タンパク質)ノックインマウスを作製し、次年度の解析に使用できるようにホモ接合体マウスの繁殖体制を整え、血液学的解析を行うための予備実験を完了した。
2: おおむね順調に進展している
レトロウイルスベクターを用いたshRNA導入によるGemininの恒久的なノックダウンシステムを確立し、Gemininの発現量を低下させることにより造血前駆細胞や造血幹細胞の活性を増幅させることに成功した。また、造血幹細胞におけるGemininの発現動態を可視化することのできるGeminin-EYFP(黄色蛍光タンパク質)ノックインマウスの作製に成功し、次年度の解析を行う準備を整えることができた。
造血幹細胞におけるGemininの発現動態を可視化するために作製したGeminin-EYFP(黄色蛍光タンパク質)ノックインマウス由来の造血幹細胞に対して、前年度までに確立したGeminin発現制御系を応用することにより、造血幹細胞の自己複製制御におけるGemininの役割を解明する。具体的には、セルソーターを用いて、ノックインマウスの骨髄細胞を免疫学的表現系から、造血幹細胞、多分化能性造血前駆細胞そして造血前駆細胞に分画し、それぞれの分画におけるGeminin-EYFPの発現強度を調べる。次に、造血幹細胞、多分化能性造血前駆細胞のそれぞれについてGeminin-EYFPの発現強度により亜分画に分けシングルセルソーティングを行ない、それぞれの細胞における造血活性(コロニー形成能、LTC-IC活性、競合的長期骨髄再構築能)やそのコロニー細胞やドナー由来の再構築細胞の性状を免疫細胞染色やフローサイトメトリーで調べ、Gemininの発現と造血幹細胞活性、特に自己複製能との相関を明らかにする。さらにGemininの発現を操作することにより自己複製能を含めた造血幹細胞の活性をex vivoで増幅させるストラテジーを模索する。
研究費の過半は、消耗品費に使用する予定である。具体的には、細胞培養に用いる培地・薬品・プラスティック製消耗品・サイトカイン類、動物飼料、抗体などに使用する。また、2回の国内学会での発表を予定しているので、その旅費を計上する。
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すべて 雑誌論文 (4件) (うち査読あり 4件) 学会発表 (5件) 備考 (1件)
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