研究課題
Photoactivatable Creタンパク質を作成する為、LOVドメインとCreタンパク質を作成し、CMV-lox-stop-lox-GFPカセットを持つベクターとHEK細胞に共導入した。CMV-lox-stop-lox-GFPはCre活性によりlox-stop-loxが除かれると上流にあるCMV promoterの働きによりGFPを発現する様になる。また、光をいちいち当てずにも光活性化を検出する為、光を当てた状態のLOVを模倣するI539E変異体、並びに光を当てていない状態を模倣するC450A変異体を融合したCreを作成し、両者での活性の際を観察した。LOVドメインは、CreのC末端、並びにN末端に融合し、またその長さをCreの結晶構造を参考に、ぎりぎりまで削ったものから、1アミノ酸ずつ、15アミノ酸までの異なった長さにものを作成した。その結果、殆どの構築でGFPの蛍光が見られた、つまりLOVドメインによるCre活性の抑制が見られなかった。恐らく、ごく少数のCre分子が、活性化されただけでもlox-stop-loxを除いてしまい、GFPの転写が起こってしまうと考えられた。これを解決する為、Cre-LOVドメイン融合蛋白の発現プラスミド量をごく少量にするなどの工夫を行なったが、残念ながらI539E変異体でGFPの発現が見られ、C450A変異体で見えないような融合蛋白は無かった。しかし、一部のタンパク質でGFPがその他よりも暗いものが認められ、Cre活性の抑制が掛かっている可能性がある。そこで、今後はその構築を中心に、結合部位に変異を入れて、両者で差があるものが得られないか検討していく。
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RNA
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http://glutamate.brain.riken.jp